菊芋去花對菊芋生長發(fā)育的影響以及對參與生長階段調(diào)控基因NF-YB家族的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、植物開花在植物的生命周期中起著重要的作用，植物通過開花途徑使植物由營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段轉(zhuǎn)換?；ㄆ诘恼{(diào)控與植物的生物量有著密切的關(guān)系，在中國農(nóng)業(yè)發(fā)展歷史中，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者通過打頂技術(shù)來控制作物的開花進(jìn)而來提高作物的產(chǎn)量已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。因南芋一號(NY-1)不開花，本論文以菊芋品種青芋二號(QY-2)為試材，在溫室進(jìn)行土培實(shí)驗(yàn)，研究了去花處理對青芋二號(QY-2)塊莖干物質(zhì)和糖分含量分配的影響。已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子NF-Y

2、B家族參與了植物的花期調(diào)控的光周期途徑和逆境調(diào)控。我們從菊芋中分離克隆了五條NF-YB轉(zhuǎn)錄因子(南芋1號，NY-1)，并對其在菊芋全生育期去花處理和幼苗干旱、高鹽脅迫條件下的組織特異性表達(dá)進(jìn)行了分析，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥對其功能以及亞細(xì)胞定位進(jìn)行了初步分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1.去花處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉片中主要糖分是還原糖，塊莖、莖中主要是非還原糖。青芋二號（QY-2）在開花期時(shí)總生物量達(dá)到最大值，之后地上部生物量減少

3、，地下部由于此時(shí)塊莖正處于膨大生長階段，生物量繼續(xù)增加。去花處理對青芋二號(QY-2)的塊莖生物量有著明顯的影響，具體表現(xiàn)為塊莖數(shù)量增多了39.67％，塊莖個(gè)頭變大了59.46％，塊莖干重比對照的增加22.53％。去花植株相同干重下的塊莖組織中的總糖含量與未去花植株相比顯著降低但還原糖含量沒有差異。通過HPLC-ELSD（高效液相色譜—蒸發(fā)光檢測儀）檢測發(fā)現(xiàn)去花處理對糖的成分與含量也有影響，蔗果五糖含量增加了32.47％，更高聚合度的果

4、聚糖有增加的趨勢，但是其他糖的含量與對照相比差異不大。
　　2.利用其他物種的NF-YB到菊芋和向日葵的EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，通過EST序列的篩選和拼接，獲得了五條包含ORF全長的EST序列并設(shè)計(jì)特異引物，從菊芋中克隆到了五條可能的NF-YB基因，序列分析表明這五條基因具有NF-YB所特有的保守結(jié)構(gòu)域H2A，通過和已被證明的擬南芥NF-YB基因家族進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)同源性比對表明從菊芋中分離克隆得到的五個(gè)基因序列同擬南芥的

5、NF-YB基因有著很高的相似性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HtNF-YB2和AtNF-YB2，AtNF-YB3存在已被證實(shí)的具有特異性結(jié)合功能性氨基酸區(qū)域即VSR，可推測Ht NF-YB具有AtNF-YB2和AtNF-YB相同或相似功能。
　　3.對全生育期南芋一號（NY-1）和干旱、高鹽脅迫處理的南芋一號(NY-1)幼苗材料，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析五條菊芋NF-YB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的特異性。結(jié)果表明，全生育期實(shí)驗(yàn)中HtNF-YB2，Ht NF-YB1

6、1，HtNF-YB13在葉中特異表達(dá)，HtNF-YB8特異在特定階段的根和花中表達(dá)，同時(shí)去花處理對Ht NF-YB2和Ht NF-YB10的表達(dá)模式有影響;5個(gè)菊芋NF-YB基因都可能參與了菊芋鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制，同時(shí)有4個(gè)還受到了干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，分別是HtNF-YB2、Ht NF-YB10、HtNF-YB11、HtNF-YB13，表明他們可能參與了植物逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制，在植物的抗逆過程中發(fā)揮重要作用。
　　4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

7、擬南芥方法，將五條菊芋NF-YB基因cDNA的編碼區(qū)插入到表達(dá)載體pCAMBIA1302中，構(gòu)建過表達(dá)融合載體，然后電轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，最后用含有目的基因的農(nóng)桿菌由花浸泡法進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了F1代。把構(gòu)建好的過表達(dá)融合載體通過基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，25℃暗培養(yǎng)12～24h后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察，查明HtNF-YB的定位情況，研究結(jié)果表明:菊芋的三個(gè)NF-YB基因Ht NF-YB2、HtNF-YB8、HtNF-Y