胃癌及轉移淋巴結中Vav1表達及與腫瘤耐藥關系的研究.pdf

1、目的：據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)胃癌位居惡性腫瘤第4位，每年新發(fā)胃癌約90余萬人，死亡約70萬人。我國屬于胃癌的高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)胃癌患者人數(shù)約占世界范圍內(nèi)的42％。胃癌患者早期癥狀及體征不明顯，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于進展期，甚至晚期，手術治療輔以化療已經(jīng)成為最常見的治療方式。合理化療可以提高胃癌患者治療療效，并延長生存時間。腫瘤的多藥耐藥性（Multiple drug resistance, MDR）是影響患者治療療效的關鍵因素。MDR包括原發(fā)性耐

2、藥和繼發(fā)性耐藥，其作用機制極度復雜，由多因素、多步驟參與，并且轉移過程中腫瘤耐藥性會發(fā)生異質性改變。通過對多藥耐藥蛋白1（Multidrug resistance MDR1）/P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）、多藥耐藥相關蛋白1（Multidrug resistance protein1 MRP1）、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase TS）、谷胱甘肽轉移酶（Glutathione-S-trans

3、ferase GST-π）等多個耐藥蛋白以及與之相關的分子機制的深入研究是逆轉化療失敗的關鍵。因此積極尋找新的胃癌耐藥相關因子有重要意義。Vav1是一種原癌基因。它具有鳥苷酸交換因子（GEF）活性，屬于 Db1家族中的一員，已有研究發(fā)現(xiàn) Vav1在多種惡性腫瘤中有表達，并在腫瘤局部進展與遠處轉移過程中發(fā)揮著非常重要的作用，是惡性腫瘤患者預后不良的標志之一。研究發(fā)現(xiàn)[1] Vav1能夠顯著上調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2的轉錄活性，從而使細胞免

4、于凋亡，Vav1的GEF活性是上調(diào)Bcl-2所必須的。而 Bcl-2可通過協(xié)調(diào) P-gp增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的耐藥[2]，由此可推測 Vav1與腫瘤的 MDR可能存在較密切關系。
　　本研究以42例進展期胃癌原發(fā)病灶組織及轉移淋巴結組織為研究對象，采用實時熒光定量 PCR法（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qPCR）檢測Vav1的mRN

5、A在兩種不同胃癌組織中的表達差異及關系。應用免疫組織化學染色技術檢測 Vav1、MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π在胃癌及轉移淋巴結中的表達，并對Vav1與四種耐藥蛋白在胃癌及轉移淋巴結中的表達的相關性進行研究。采用四氮唑藍法（MTT）檢測不同機制化療藥（氟尿嘧啶5-FU、足葉乙苷 VP-16、紫杉醇 PTX、順鉑 CDDP、氨甲喋呤 MTX）對胃癌原發(fā)灶和相應轉移淋巴結細胞的抑制情況，并進行對比分析，探討 Vav1與胃癌M

6、DR的關系及意義。
　　方法：
　　收集42例進展期患者胃癌組織及轉移淋巴結新鮮組織標本及相應患者的中性甲醛所固定胃癌及轉移淋巴結組織標本，采用實時熒光定量PCR技術，在mRNA水平檢測 Vav1在胃癌組織及轉移淋巴結中的表達，另采用免疫組織化學染色法在蛋白水平檢測 Vav1及相關耐藥蛋白（MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π）在胃癌及轉移淋巴結中的表達。通過做相關分析，明確 Vav1與腫瘤耐藥相關蛋白的關系及意義

7、。采用四氮唑藍法（MTT）檢測化療藥（氟尿嘧啶5-FU、足葉乙苷 VP-16、紫杉醇 PTX、順鉑 CDDP、氨甲喋呤 MTX）對5組細胞體外化療藥敏性。所得數(shù)據(jù)應用 SPSS21.0軟件進行分析，計量資料的比較采用 t檢驗。計數(shù)資料應用χ2檢驗。相關性的分析應用 spearman相關分析。P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1 Vav1蛋白與mRNA在胃癌及轉移淋巴結組織中的表達強度差異以及相關性：
　　V

8、av1蛋白在轉移淋巴結組織中的表達明顯高于胃癌組織（χ2=5.927，P=0.015），在轉移淋巴結組織與胃癌原發(fā)灶組織中 Vav1蛋白表達具有明顯相關性（r=0.359，P=0.019）。Vav1 mRNA在轉移淋巴結組織中的表達高于胃癌組織（0.379±0.233 vs0.123±0.081，t=7.818， P=0.000），且二者之間有明顯相關性（r=0.418，P=0.006）。
　　2 MDR1/P-gp、TS、MRP

9、1、GST-π蛋白在胃癌及轉移淋巴結組織中的表達以及相關關系：
　　MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在轉移淋巴結組織中的表達明顯高于胃癌組織（χ2=5.974；χ2=7.683；χ2=4.421；χ2=4.266， P=0.015, P=0.006；P=0.035；P=0.039）。在轉移淋巴結組織與胃癌原發(fā)灶組織間 MDR1/P-gp、MRP1、GST-π蛋白表達具有明顯的相關性（ r=0.380；r=0.33

10、6；r=0.311， P=0.013， P=0.030；P=0.045）；在轉移淋巴結組織與胃癌原發(fā)灶組織中 TS蛋白無明顯相關關系（ r=0.28， P=0.072）。
　　3在胃癌及轉移淋巴結組織蛋白水平 Vav1與 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π間的相關關系。
　　胃癌組織中 Vav1與 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π的表達，在蛋白水平呈正相關關系（ r=0.378；r=0.440；r=

11、0.437；r=0.348， P=0.014；P=0.004；P=0.004；P=0.024）。
　　轉移淋巴結組織中 Vav1與 MDR1/P-gp、MRP1在蛋白水平的表達呈正相關關系（ r=0.365；r=0.335， P=0.017；P=0.030）；而 Vav1與TS、GST-π在胃癌轉移淋巴結組織中蛋白表達水平無明顯相關關系（r=0.229；r=0.023， P=0.136；P=0.883）。
　　45-FU、V

12、P-16、PTX、CDDP、MTX在胃癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶之間體外化療藥敏性比較
　　胃癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶中的化療藥物抑制率比較， VP-16對轉移淋巴結瘤細胞抑制率明顯較原發(fā)灶高（ t=-2.28， P=0.025）；而5-FU、PTX、CDDP、MTX，對胃癌原發(fā)灶及淋巴結轉移灶的瘤細胞抑制率之間的差異無統(tǒng)計學意義（ t=-1.23；t=-0.94；t=1.06；t=0.69, P=0.223；P=0.352；P=0.2

13、91；P=0.490）。
　　5 Vav1、MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶表達與相應組織中瘤細胞體外化療藥敏感性關系
　　胃癌原發(fā)灶中 Vav1弱表達組對5-FU、PTX的瘤細胞抑制率明顯高于強表達組（t=2.34,t=2.14, P=0.024；P=0.038）。P-gp強表達組對5-FU的瘤細胞抑制率明顯低于弱表達組，（t=2.71, P=0.010）。TS強表達組對5-FU

14、、CDDP的瘤細胞抑制率明顯低于低表達組（ t=4.40； t=2.19, P=0.000；P=0.019）。MRP1強表達組對5-FU、PTX、CDDP的瘤細胞抑制率明顯低于弱表達組（t=2.12；t=2.09；t=4.26, P=0.040；P=0.043；P=0.000）。GST-π強表達組對5-FU、PTX、CDDP的瘤細胞抑制率明顯低于弱表達組（ t=2.17；t=2.48；t=2.13, P=0.036；P=0.017；P=

15、0.040）。
　　淋巴結轉移灶中 Vav1弱表達組對5-FU、CDDP的瘤細胞抑制率明顯高于強表達組（t=2.10；t=2.37, P=0.042；P=0.023）。P-gp強表達組對5-FU、PTX、CDDP的瘤細胞抑制率明顯低于弱表達組(t=2.34；t=2.05；t=2.11， P=0.025；P=0.047；P=0.041)。TS強表達組對5-FU、PTX的瘤細胞抑制率明顯低于弱表達組（ t=2.13；t=2.27， P

16、=0.039；P=0.029）。MRP1強表達組對5-FU的瘤細胞抑制率明顯低于弱表達組（t=3.85，P=0.000）。GST-π強表達組對 CDDP的瘤細胞抑制率低于低表達組（t=3.16，P=0.003）。
　　結論:
　　1 Vav1蛋白質和mRNA在胃癌轉移淋巴結組織中的表達水平明顯高于胃癌組織，表明 Vav1在胃癌組織和轉移淋巴結病灶之間存在異質性，提示 Vav1可能參與了胃癌的侵襲轉移過程，是胃癌進展的一個重要

17、因素。
　　2 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌組織中的表達水平明顯低于轉移淋巴結病灶，說明耐藥蛋白在胃癌及轉移淋巴結中存在異質性表達，提示轉移病灶耐藥性更強以及有更強的進展趨勢。
　　3胃癌組織的Vav1表達水平與MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π呈正相關性，轉移淋巴結中 Vav1表達水平與 MDR1/P-gp、MRP1呈正相關關系，提示胃癌組織中 Vav1參與的侵襲、轉移在疾病進展過程

18、可能與胃癌耐藥分子網(wǎng)絡存在著交叉，或通過某種調(diào)控機制共同促進胃癌的進展。
　　4通過體外藥敏實驗結果顯示胃癌轉移淋巴結細胞對 VP-16敏感性明顯高于原發(fā)灶，而對5-FU、PTX、CDDP、MTX的藥敏性不同，提示胃癌轉移過程中耐藥性發(fā)生了異質性改變，以原發(fā)灶的耐藥結果并不能全面、準確地推斷淋巴結轉移灶的藥敏性。
　　5在胃癌及轉移淋巴結細胞中 MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π的表達對5-FU、VP-16、PT

19、X、CDDP、MTX敏感性不同，提示胃癌及轉移淋巴結中化療藥敏性存在異質性改變。只以任何一種 MDR相關因子
　　反映胃癌原發(fā)灶與轉移灶的藥敏性均是不全面的。在胃癌原發(fā)灶中 Vav1表達對5-FU敏感性降低，而在轉移淋巴結中對 CDDP的敏感性降低，提示 Vav1可能參與了 MDR過程，并在某種程度上可預測 MDR，但在胃癌轉移過程中耐藥性發(fā)生了改變。對 VP-16、CDDP、MTX敏感性無顯著差異，提示Vav1只是胃癌MDR調(diào)節(jié)