Mormyrid電感受葉顆粒細(xì)胞對(duì)傳入纖維動(dòng)作電位的調(diào)控和電突觸在電魚腦內(nèi)分布的研究.pdf

1、來(lái)自南美洲和非洲的一種淡水電魚Mormyrid，有著非常發(fā)達(dá)的小腦和小腦樣結(jié)構(gòu)。 本課題采用可視情況下的腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)、注射生物素(biocytin)、神經(jīng)生物素(neurobicytin)標(biāo)記細(xì)胞、以及染色耦合(dye Cpupling)技術(shù)，并通過建立傳入纖維和顆粒細(xì)胞之間的電突觸聯(lián)系的計(jì)算機(jī)模型，對(duì)電魚電感受葉顆粒細(xì)胞的形態(tài)特征、電生理特性、和突觸反應(yīng)，進(jìn)行了較詳細(xì)的觀察，以揭示顆粒細(xì)胞在電感受傳入通路中對(duì)外周信息

2、的解碼機(jī)制，及其在整合傳入信號(hào)過程中進(jìn)行精確時(shí)間編碼(temporal coding)和重合檢測(cè)時(shí)所起的作用。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還利用特異性標(biāo)記神經(jīng)系統(tǒng)電突觸連接子Connexin-36的抗體，用免疫細(xì)胞化學(xué)和Westerrl blot等技術(shù)，分析電魚Mormyrid腦內(nèi)構(gòu)成電突觸的連接體(connexon)的分子組成和電突觸的分布情況；并用一些束路追蹤(tract tracing)手段，對(duì)mormirid電感受葉中的神經(jīng)環(huán)路組成作了進(jìn)一步闡明

3、。 第一部分：電感受葉顆粒細(xì)胞對(duì)電感受傳入纖維動(dòng)作電位的發(fā)生和幅度調(diào)控的腦片膜片鉗研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 1.細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外注射Biocytin進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后均可見，表層顆粒細(xì)胞胞體直徑約3～5μm，有主富的底樹突，軸突可投射至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion layer)或分子層底層；深層顆粒細(xì)胞胞體直徑約5～7μm，只有少量的底樹突，其軸突僅投射至網(wǎng)狀層(plexiform layer)或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層基底部

4、，深層顆粒細(xì)胞軸突起始部位較細(xì)，離開胞體10～20Fm后突然加粗，末端呈爪樣分布；放置在切斷的神經(jīng)斷端的Neurobiotin進(jìn)入到傳入神經(jīng)纖維后，可見表層顆粒細(xì)胞出現(xiàn)大量反映縫隙連接的染色耦合，而深層顆粒細(xì)胞只有少數(shù)有耦合標(biāo)記。 2.用單一電刺激興奮傳入神經(jīng)纖維，可以在表層和深層顆粒細(xì)胞記錄到“全或無(wú)”式的EPSP。 3.eEPSP的幅度可隨著突觸后細(xì)胞本身膜電位的改變而改變。 4.隨著刺激電極放置位置的

5、改變，同一顆粒細(xì)胞上除了可以記錄到“全或無(wú)”式的eEPSP外，尚可記錄到“全或無(wú)”式的IPSP、或者兩種電位的復(fù)合，表明顆粒細(xì)胞有可能分別接受興奮性、抑制性傳入纖維，或同時(shí)接受兩種不同類型的傳入纖維。 以上結(jié)果表明： (1)Mormyrid小腦電感受葉表層和深層的顆粒細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能特性上是完全不同的兩類細(xì)胞，不僅有胞體分布位置、細(xì)胞形態(tài)、軸突投射部位的不同，Neurobiotin染色耦合的特點(diǎn)也不同。 (2)表層和深層的顆粒

6、細(xì)胞均可記錄到eEPSP，并且根據(jù)染色耦合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合以前的電鏡觀察，表明傳入纖維和顆粒細(xì)胞之間存在有電突觸。 (3)特別值得提出的是，表層和深層顆粒細(xì)胞均可由于自身膜電位的改變，通過電突觸，對(duì)突觸前末梢傳入進(jìn)行調(diào)控；它是一種尚未報(bào)道過的突觸傳遞的調(diào)控形式，有特殊的功能意義。(4)Mormyrid小腦電感受葉的同一顆粒細(xì)胞可以分別或同時(shí)接受興奮性或抑制性的傳入纖維，從而產(chǎn)生eEPSP或IPSP。 第二部分：顆粒細(xì)胞膜電位對(duì)

7、EPSP幅度調(diào)節(jié)的計(jì)算機(jī)建模研究 在體電生理實(shí)驗(yàn)表明，Mormyrid的電感受傳入纖維通過其動(dòng)作電位的數(shù)目、尤其是通過動(dòng)作電位的潛伏期來(lái)編碼外周信號(hào)刺激強(qiáng)度，傳入纖維可以通過非常精確的時(shí)間分辨來(lái)反映周圍環(huán)境的改變。那么，與感覺傳入纖維形成電突觸聯(lián)系的顆粒細(xì)胞又是通過何種機(jī)制將外周信息精確地傳入高級(jí)中樞?在第一部分腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)證實(shí)了突觸后顆粒細(xì)胞自身膜電位變化對(duì)突觸前傳入一末梢動(dòng)作電位的發(fā)生和幅度具有精確的調(diào)控。為

8、了進(jìn)一步檢驗(yàn)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和我們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出的假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)利用電生理學(xué)記錄的資料和數(shù)據(jù)，使用適當(dāng)?shù)膮?shù)，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)技術(shù)，建立了以電突觸為聯(lián)系方式的電感受器傳入纖維一顆粒細(xì)胞的計(jì)算機(jī)房室模型(compartmental Model)。 第三部分：電魚Mormyrid腦內(nèi)縫隙連接的分布： 本實(shí)驗(yàn)以Cx36和Cx45的多克隆抗體，運(yùn)用免疫組織化學(xué)、westem blot，結(jié)合biotinylated-dextran a

9、mine(BDA)順行和逆行追蹤標(biāo)記、雙標(biāo)染法、和激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段，對(duì)縫隙連接連接子蛋白Cx36和Cx45在電魚腦內(nèi)的分布情況進(jìn)行了研究，旨在分析縫隙連接的連接子蛋白(每6個(gè)連接子蛋白單體組成一個(gè)六聚體的水相通道，稱為connexon，即連接體)和連接體的結(jié)構(gòu)和組成，以便對(duì)電感受信號(hào)的傳入通路及命令信號(hào)的傳出通路做進(jìn)一步的理解，進(jìn)一步分析它們可能對(duì)電感受信號(hào)的傳導(dǎo)通路作出的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 1

10、.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Mormyrid腦組織中，Cx36抗體可檢測(cè)到分子量為35kD和70kD的蛋白肽段，Cx45抗體卻未能顯示出分子量為45KD的蛋白肽段。然而在大鼠腦組織中，Cx45抗體能特異性地檢測(cè)到分子量為45kD蛋白肽段。這表明，Mormyrid腦內(nèi)的縫隙連接可能不存在連接子蛋白Cx45。 2.使用Cx36抗體，我們成功地標(biāo)記了以往公認(rèn)的存在有縫隙連接的部位，如電感受葉的深層顆粒細(xì)胞、電感受葉神經(jīng)

11、核(nELL)、半規(guī)隆凸外側(cè)核(ELa)、命令神經(jīng)核(CN)、延髓中繼核(MRN)、以及Maunthner細(xì)胞等。 3.使用生物素化右旋糖胺(BDA)逆行標(biāo)記法，發(fā)現(xiàn)了以前未曾報(bào)道過的一些存在縫隙連結(jié)的區(qū)域，如前命令核(PCN)、腹背側(cè)核(VPN)、隆起前核(PE)、網(wǎng)狀-脊髓神經(jīng)元以及次級(jí)聽神經(jīng)核等。 4.使用BDA順行標(biāo)記法，成功地顯示了命令神經(jīng)元所在核CN的傳導(dǎo)通路和它的側(cè)支通路(corollary pathw

12、ay)，側(cè)支通路包括延髓命令相關(guān)核(BCA)、中腦命令神經(jīng)元(MCA)、旁葉核(JLNm)、旁三叉神經(jīng)命令相關(guān)核(PCA)等。然而，令人感興趣的是，與側(cè)支通路有關(guān)的這些部位的Cx36抗體標(biāo)記均呈現(xiàn)陰性結(jié)果。 5.電感受葉表層顆粒細(xì)胞的Cx36抗體標(biāo)記也呈現(xiàn)陰性結(jié)果。 小結(jié)：在本研究中發(fā)現(xiàn)，突觸后顆粒細(xì)胞可以通過改變其自身膜電位，通過電突觸，對(duì)傳入神經(jīng)纖維上的動(dòng)作電位的產(chǎn)生與否和幅度大小進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而對(duì)突觸后電位的進(jìn)行

13、精細(xì)調(diào)節(jié)：同時(shí)，傳入纖維和顆粒細(xì)胞具有的多突觸聯(lián)系方式和表現(xiàn)出的非線性相加現(xiàn)象，證實(shí)了顆粒細(xì)胞在感覺信息傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要的整合作用，為顆粒細(xì)胞所具有的高時(shí)間分辨率和精確傳遞外界信息的功能，提供了理論依據(jù)；模型實(shí)驗(yàn)研究成功地再現(xiàn)了電生理實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，為下一步進(jìn)行更深入的顆粒細(xì)胞模型研究，也為深入研究電感受葉顆粒細(xì)胞對(duì)外周及中樞傳入信息的精確整合機(jī)制提供了一個(gè)可靠平臺(tái)；免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記電魚腦內(nèi)電突觸組成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，既發(fā)現(xiàn)了新的縫隙連接