力學(xué)環(huán)境對(duì)大鼠骨折愈合早期骨斷端MSCs募集和分化的影響.pdf

1、骨折愈合是指骨折、截骨、關(guān)節(jié)融合和骨移植術(shù)后的自然骨連接過(guò)程。骨折愈合的影響因素眾多，其中骨折區(qū)的力學(xué)環(huán)境是一個(gè)重要的方面，骨折經(jīng)適合固定后再誘發(fā)骨折端細(xì)微運(yùn)動(dòng)，能刺激骨痂生長(zhǎng)，加速骨折愈合過(guò)程。然而，關(guān)于力學(xué)環(huán)境影響骨愈合過(guò)程的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制目前仍不甚清楚。本課題組早前在臨床治療中發(fā)現(xiàn)：完全固定不能加速骨折的痊愈，適當(dāng)給予病人一定的活動(dòng)量卻可以加速骨折愈合，并加速病人恢復(fù)肢體的功能。因此，探討骨折斷端的力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折愈合過(guò)

2、程的影響不僅可理解骨折愈合機(jī)制，而且對(duì)臨床骨折的治療、康復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來(lái)源于中胚層的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，能夠向成骨、成軟骨細(xì)胞等方向分化，骨折損傷部位對(duì)MSCs的募集在骨修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，骨折端募集足夠數(shù)量的MSCs是骨折愈合的前提條件和重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。研究力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折端的干細(xì)胞募集和分化的影響對(duì)于從細(xì)胞水平和分子水平認(rèn)識(shí)骨折愈合機(jī)制可提供

3、新證據(jù)，進(jìn)而對(duì)臨床骨折的治療和康復(fù)過(guò)程的設(shè)計(jì)和力度控制具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。
　　骨折愈合早期是力學(xué)刺激促進(jìn)骨折愈合最為有效的時(shí)期，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)制備大鼠骨折動(dòng)物模型，以不同剛度系數(shù)外固定架固定為骨折區(qū)提供不同力學(xué)環(huán)境的方法，利用流式細(xì)胞術(shù)、RT-qPCR、Western-blot等技術(shù)手段，觀察不同力學(xué)環(huán)境對(duì)骨斷端 MSCs募集和分化的影響。
　　研究目的：
　　1．通過(guò)建立不同剛度系數(shù)外固定架固定大鼠股骨骨折的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

4、，以給予骨折股骨不同的力學(xué)環(huán)境，觀察骨折愈合早期不同力學(xué)環(huán)境對(duì)骨斷端MSCs的募集是否產(chǎn)生不同影響，從細(xì)胞水平解釋不同力學(xué)環(huán)境對(duì)骨折愈合的影響。
　　2．從分子水平揭示骨折局部不同力學(xué)環(huán)境在骨折愈合早期對(duì)骨斷端MSCs向成骨細(xì)胞譜系和軟骨細(xì)胞譜系分化的不同影響。
　　3．為骨折愈合機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)臨床骨折的治療及康復(fù)中的力學(xué)控制設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1．建立大鼠股骨骨折模型，以不同剛

5、度系數(shù)的外固定架予以固定，設(shè)置對(duì)照組（剛度系數(shù)60.6 N/mm）、高剛度組（剛度系數(shù)18.2 N/mm）和低剛度組（剛度系數(shù)8.5 N/mm）。
　　2．于術(shù)后當(dāng)天、2周后拍攝X-光片，觀察骨折愈合情況；術(shù)后6周，對(duì)骨痂組織進(jìn)行組織學(xué)研究。
　　3．于術(shù)后2天、4天、6天、10天，將骨折斷端組織取出，分離并計(jì)數(shù)有核細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離所得細(xì)胞中 MSCs所占的比例。計(jì)算得到三組不同天數(shù)骨斷端CD29+CD90+（MS

6、Cs）的絕對(duì)數(shù)目。
　　4．于術(shù)后2天、6天、10天、14天分別取骨痂組織，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)其中成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix（OSX）及成軟骨相關(guān)基因Sox9的表達(dá)水平。并通過(guò)Western-blot檢測(cè)Runx2、Sox9蛋白的表達(dá)。觀察骨斷端力學(xué)環(huán)境對(duì)干細(xì)胞分化影響。
　　研究結(jié)果：
　　1．影像學(xué)研究顯示，術(shù)后2周時(shí)高剛度組骨痂量明顯少于低剛度組。組織學(xué)研究顯示，高剛度組大鼠股骨骨折模型均達(dá)到了骨

7、性鏈接，但骨痂較少。低剛度組大鼠股骨骨折模型出現(xiàn)了軟骨鏈接，但軟骨部分非常薄，最終沒(méi)有發(fā)生骨化。
　　2．隨愈合時(shí)間增加，分離得到有核細(xì)胞數(shù)目呈減少趨勢(shì)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD29+CD90+（MSCs）細(xì)胞比例不斷減少，最終計(jì)算得到MSCs的絕對(duì)數(shù)目2天>4天>6天>10天（P<0.05）；術(shù)后同天組間比較，低剛度組多于高剛度組，高剛度組多于對(duì)照組（P<0.05）。
　　3．Runx2、OSX的表達(dá)水平在14天之內(nèi)不斷

8、升高。Sox9的表達(dá)，對(duì)照組和高剛度組在術(shù)后10天最高，14天有所下降，低剛度組在術(shù)后14天之內(nèi)一直升高。14天之內(nèi)Runx2、OSX及Sox9的表達(dá)水平組間基本低剛度組>高剛度組>對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1．在骨折愈合早期，骨折區(qū)力學(xué)環(huán)境會(huì)影響募集的MSCs的數(shù)目。固定強(qiáng)度低時(shí)，骨折端微動(dòng)多，募集的MSCs增多。
　　2．在骨折愈合早期，骨折區(qū)力學(xué)環(huán)境會(huì)影響 MSCs向成骨、成軟骨細(xì)胞譜系的分化。固定強(qiáng)度低時(shí)，骨折