鐵皮石斛多糖結(jié)構(gòu)及其硫酸化衍生物活性研究.pdf

1、目的：研究鐵皮石斛中多糖大分子及其衍生物的結(jié)構(gòu)特征與生物活性，為研究鐵皮石斛中基于大分子多糖的生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其相關(guān)質(zhì)量控制以及基于石斛多糖創(chuàng)新藥物研究奠定理論與物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：本課題采用沸水提-乙醇沉、氫氧化鈉提-乙醇沉的方法獲得鐵皮石斛水提粗多糖以及鐵皮石斛堿提粗多糖。采用酶解法，陰離子交換法以及凝膠過(guò)濾色譜法分離純化出均一多糖。采用糖組成分析，部分酸水解、甲基化、紅外、核磁等化學(xué)和物理的方法對(duì)多糖性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解

2、析。采用氯磺酸-吡啶法（1:3）進(jìn)行多糖的硫酸化衍生。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）的管腔形成實(shí)驗(yàn)以及劃痕遷移實(shí)驗(yàn)用來(lái)考察鐵皮石斛多糖及其硫酸化衍生物的抗血管生成能力。MTT法來(lái)檢測(cè)鐵皮石斛多糖及其衍生物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株增殖的抑制作用以及對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2和HMEC-1細(xì)胞的毒性。
　　結(jié)果：（1）從1.5 Kg鐵皮石斛干燥莖中得到水提粗多糖DOW304.0 g（得率為20.3％）和堿提粗多糖DOA14.0 g（得率為0.9%

3、）。（2）DOW經(jīng)分離純化后得到兩種均一多糖5A以及5B，分子量分別為1.6×104 Da和8.2×103 Da。糖組成分析表明：5A由葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）組成，其摩爾比例為55.7:39.7:1.4:0.6:2.6，結(jié)構(gòu)分析表明5A是以1,4-α-D-Glcp、1,4-β-D-Man

4、p為主鏈，支鏈主要包括α和β構(gòu)型的末端（terminal，T）-D-Glcp、T-Xyl以及T-Ara。支鏈連接于主鏈糖殘基1,4-α-D-Glcp的C-6位；5B由Glc、Man和少量的Xyl組成，其摩爾比例為91.9:6.5:1.6，結(jié)構(gòu)分析表明5B是以1,4-α-D-Glcp和極少量的1,4-β-D-Manp為主鏈，支鏈主要包含T-α-D-Glcp，木糖可能存在于支鏈上。支鏈連接于主鏈糖殘基1,4-α-D-Glcp的C-6位。（3

5、）DOA經(jīng)分離純化后得到兩個(gè)均一酸性異木聚糖S32和S33S1，分子量分別為3.7×104Da和6.9×103 Da。糖組成分析結(jié)果表明：S32由Ara，Xyl，Glc，Gal，鼠李糖（rhamnose，Rha）和4-甲氧基-葡萄糖醛酸（4-methoxyl-glucuronic acid，4-MGA）組成，各單糖的比例為8.9:62.7:8.5:3.7:3.9:12.3；S33S1糖組成為Xyl，Ara， Glc和4-MGA，比例為6

6、.1:79.8:1.2:12.9。結(jié)構(gòu)分析表明S32和S33S1均是以1,4-β-D-Xylp為主鏈，分支連接于主鏈糖殘基的C-2位。S32的分枝主要由T-4-MeO-α-D-GlcAp、1,4-α-D-Glcp、1,3-α-L-Rhap、T-α-L-Araf、T-β-D-Galp以及 T-β-D-Xylp組成。S33S1的支鏈較簡(jiǎn)單，主要包含 T-4-MeO-α-D-GlcAp、T-β-D-Xylp以及T-α-L-Araf。（4）5B

7、和S32經(jīng)硫酸化修飾分別得到S5B和S32S，分子量分別為1.8×104 Da和5.4×104 Da。氯化鋇-明膠法測(cè)得二者硫酸基取代度分別為0.92和0.90。結(jié)構(gòu)分析表明前者的硫酸化取代位點(diǎn)主要為1,4-α-D-Glcp和T-α-D-Glcp的C-6位。而后者硫酸化位點(diǎn)主要包括1,4-β-D-Xylp的C-2或者C-3位、少部分的1,2,4-β-D-Xylp的C-3位、T-4-MGA的C-3位以及1,4-α-D-Glcp的C-6位。

8、（5）生物活性測(cè)試結(jié)果表明，未硫酸化的多糖5B和S32對(duì)HMEC-1細(xì)胞的管腔形成幾乎沒(méi)有影響，而硫酸化的多糖 S5B和 S32S均可以在低濃度（5.95μM，0.29μM）時(shí)呈現(xiàn)抑制HMEC-1細(xì)胞管腔形成和細(xì)胞遷移的活性，在較高濃度時(shí)1 mg/mL（47.62μM，18.52μM）對(duì)人正常的肝細(xì)胞LO2以及HMEC-1細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性。
　　結(jié)論：（1）本課題獲得4種均一多糖。從水提粗多糖中純化出5A和5B；從堿提粗多糖中純化