蠶蛹羧甲基殼聚糖的制備與特性及其對(duì)大鼠術(shù)后腸粘連的預(yù)防作用.pdf

1、本文以繅絲或機(jī)打絲棉片后的廢蠶蛹（簡稱繅絲蛹）為原料，利用慢速冷凍-低溫解凍的凍融循環(huán)脫乙酰技術(shù)制備蠶蛹?xì)ぞ厶?，并?jīng)過與氯乙酸的取代反應(yīng)獲得蠶蛹羧甲基殼聚糖。本文詳細(xì)地研究了這種羧基殼聚糖的物化性能和結(jié)構(gòu)特征，并研究其對(duì)成纖維細(xì)胞生長的影響以及對(duì)大鼠術(shù)后腸粘連的預(yù)防作用。
　　將繅絲蛹置于80-100?C烘箱內(nèi)加熱烘干，待水分低于5％，機(jī)械粉碎成粉末。隨后通過正己烷的萃取，得到蛹油和脫脂蛹粉。脫脂蛹粉進(jìn)一步通過氫氧化鈉脫蛋白，鹽酸

2、脫鹽和雙氧水脫色等加工步驟后得到蠶蛹甲殼素。蠶蛹甲殼素在堿性條件下經(jīng)過-20?C與40?C反復(fù)凍融處理之后，得到蠶蛹?xì)ぞ厶?。這種蠶蛹?xì)ぞ厶窃偻ㄟ^堿化和氯乙酸取代反應(yīng)制備了蠶蛹羧甲基殼聚糖。分析結(jié)果表明經(jīng)過上述凍融循環(huán)技術(shù)制備的蠶蛹?xì)ぞ厶?，其脫乙酰度?9.87%左右，粘均分子量僅為2.50×104。雖然脫乙酰度低，但是其在2%醋酸（HAc）中的溶解度仍然能達(dá)到96.73%。采用電位滴定法對(duì)蠶蛹羧甲基殼聚糖的取代度進(jìn)行了分析，結(jié)果表明這種

3、羧甲基殼聚糖為N,O-羧甲基殼聚糖，取代度為1.63，屬于高取代度羧甲基殼聚糖。本文采用了SEM、XRD、DSC、FTIR和XPS等分析方法，對(duì)蠶蛹樣品的物理特性進(jìn)行更全面和詳細(xì)的研究。SEM的分析證明蠶蛹?xì)ぞ厶呛汪燃谆鶜ぞ厶菢悠放c對(duì)照品相比，表面更加不平整且顆粒斷裂情況嚴(yán)重。XRD、DSC、FTIR等分析結(jié)果表明，這種蠶蛹來源樣品的主要分子鏈結(jié)構(gòu)與對(duì)照品相比無實(shí)質(zhì)性差別。但是其結(jié)晶度和熱分解溫度都有所降低。
　　本文利用小鼠L9

4、29成纖維細(xì)胞在體外探索蠶蛹羧甲基殼聚糖對(duì)其增殖的影響。結(jié)果表明其能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖，并能夠降低TGF-β1和VEGF基因的表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過磨損造成大鼠盲腸損傷粘連的模型，檢測(cè)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)及血清中的炎癥因子變化，并與現(xiàn)在臨床應(yīng)用的抗粘連產(chǎn)品的作用效果作了比較研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用60只雄性成年 SD大鼠（200-250 g/只），隨機(jī)分為空白對(duì)照（模型）組即生理鹽水處理組、陽性對(duì)照組即術(shù)億寧醫(yī)用幾丁糖凝膠處理組和實(shí)驗(yàn)樣品組即自制

5、羧甲基殼聚糖處理。SD大鼠造模成功后，在術(shù)后2周和3周分別處死動(dòng)物取血液和盲腸組織進(jìn)行腸粘連等級(jí)及細(xì)胞因子等方面的分析與檢測(cè)。處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，暴露腹腔，通過肉眼觀察判定腸粘連等級(jí)，結(jié)果顯示陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的大鼠術(shù)后腸粘連等級(jí)的平均值均低于空白對(duì)照（模型）組。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組相比較，白細(xì)胞數(shù)目無顯著差異但都明顯低于生理鹽水處理的空白對(duì)照組，說明蠶蛹羧甲基殼聚糖與醫(yī)用幾丁糖凝膠一樣具有良好的抗炎癥作用。參與腸粘連形成

6、的細(xì)胞因子種類非常多，本項(xiàng)研究結(jié)果表明蠶蛹羧甲基殼聚糖溶液能明顯降低腸粘連大鼠血清中致炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8的表達(dá)量，而對(duì)抑炎因子IL-4的表達(dá)量并無影響。
　　此外，腸粘連組織中羥脯氨酸含量分析表明，陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組明顯降低，充分表明這兩組大鼠粘連程度也明顯降低。組織病理切片觀察結(jié)果說明蠶蛹羧甲基殼聚糖溶液能夠減少損傷盲腸組織纖維組織的增生以及炎癥細(xì)胞的浸潤，其效用與醫(yī)用幾丁糖凝膠并無顯

7、著差異。TGF-β1免疫組化分析結(jié)果表明蠶蛹羧甲基殼聚糖可以降低組織中TGF-β1的表達(dá)，從而減少腹膜粘連的形成。
　　綜上所述，本文利用凍融循環(huán)的脫乙酰方法制備脫乙酰度較低的蠶蛹?xì)ぞ厶?，并通過與氯乙酸的取代反應(yīng)制備了一種新型的蠶蛹羧甲基殼聚糖。體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明這種羧甲基殼聚糖可以抑制細(xì)胞的增生，下調(diào)細(xì)胞中TGF-β1和VEGF基因的表達(dá)量；體內(nèi)腸粘連實(shí)驗(yàn)證明這種羧甲基殼聚糖通過降低機(jī)體炎癥因子（TNF-α、IL-1β、