雙歧桿菌對(duì)新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型保護(hù)作用的研究.pdf

1、壞死性小腸結(jié)腸炎（Necrotizing enterocolitis, NEC）是新生兒嚴(yán)重的腸道炎癥性疾病，大多發(fā)生在早產(chǎn)兒，特別是極低出生體重兒（Very low birth weight, VLBW）。嚴(yán)重的 NEC可能需要手術(shù)干預(yù)，而手術(shù)干預(yù)的 NEC患兒死亡率較高。另外術(shù)后除了容易發(fā)生短腸綜合征、消化不良等并發(fā)癥外，還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙。目前認(rèn)為 NEC與早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、腸道過激炎癥反應(yīng)等有關(guān)，然而確切的發(fā)病機(jī)制目前不太清楚。

2、Toll樣受體（ Toll like receptors，TLRs）是一類跨膜受體，通過識(shí)別相應(yīng)的病原相關(guān)模式分子（ Pathogen associated molecular pattern, PAMP）然后釋放信號(hào)，是先天免疫的重要組成。目前發(fā)現(xiàn) TLR4信號(hào)與 NEC發(fā)病關(guān)系密切。適當(dāng)?shù)?TLR4信號(hào)釋放對(duì)腸道的免疫反應(yīng)以及腸道發(fā)育是有益的，然而過度的 TLR4信號(hào)釋放會(huì)引起腸道嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，最終引起 NEC。Toll作用蛋白（

3、Toll interacting protein, TOLLIP）及單 Ig區(qū) IL-1相關(guān)受體（ Single Ig IL-1-related receptor, SIGIRR）是 TLR4信號(hào)中的抑制因子， TOLLIP和 SIGIRR可以減輕TLR4的信號(hào)傳遞，減輕炎癥反應(yīng)。
　　雙歧桿菌是益生菌中的一種，是腸道優(yōu)勢(shì)菌群之一。雖然隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（ Randomized controlled trials, RCTs）發(fā)現(xiàn)雙歧桿

4、菌可以有效預(yù)防早產(chǎn)兒發(fā)生 NEC發(fā)生，但是雙歧桿菌預(yù)防 NEC的效果一直存在爭(zhēng)議，雙歧桿菌預(yù)防 NEC的作用機(jī)制尚未清楚。本文旨在研究雙歧桿菌對(duì)新生 SD大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎動(dòng)物模型的影響并從雙歧桿菌對(duì) TLR4、TOLLIP和 SIGIRR基因表達(dá)的調(diào)節(jié)方面闡明可能的機(jī)制。
　　目的：研究雙歧桿菌對(duì)新生 SD大鼠 NEC模型腸道損傷的保護(hù)作用，并探討雙歧桿菌對(duì) TLR4、TOLLIP和 SIGIRR mRNA表達(dá)的影響，探討雙歧

5、桿菌保護(hù)腸道損傷的可能機(jī)制。
　　方法：（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：成年 Specific pathogen free(SPF)級(jí)雄性及雌性 SD大鼠分別3只和6只，按照雄雌比例1:2合籠。合籠第二天清晨檢查雌性 SD大鼠在是否有陰道栓確定為妊娠第0天。在孕21天剖腹獲取早產(chǎn)新生 SD大鼠45只。將45只新生大鼠隨機(jī)分成正常組（ n=14）、NEC組（ n=16）和干預(yù)組（ n=15）。（2）NEC動(dòng)物模型建立：正常組新生 SD大鼠交由近

6、日生育的母鼠代乳。NEC組及干預(yù)組的新生 SD大鼠采用 Esbilac動(dòng)物配方奶進(jìn)行人工喂養(yǎng)。首次在生后2h后開始，每次喂養(yǎng)量為0.15ml，之后每4h一次，24h后增加至0.2ml/次。NEC組和干預(yù)組新生 SD大鼠在進(jìn)食第一餐后開始造模。將新生SD大鼠置入缺氧箱中，調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁繛?5 L/min往缺氧箱內(nèi)通氣，當(dāng)測(cè)氧儀下降至0時(shí)開始計(jì)時(shí)，90 s后結(jié)束氮?dú)馔獠⒋蜷_缺氧箱。隨后將新生大鼠置入4℃冰箱冷藏室中，持續(xù)10 min。每日進(jìn)

7、行缺氧和冷刺激2次，2次間隔12h，連續(xù)72h。（3）干預(yù)方法：每日往干預(yù)組新生 SD大鼠的配方奶中添加2次雙歧桿菌，每次1×108cfu，兩次間隔12h。 NEC組和正常組無添加雙歧桿菌。（4）標(biāo)本采集：生后72h采取頸椎脫臼法處死三組新生大鼠，對(duì)腹部進(jìn)行解剖。取出十二指腸至回盲部的腸管。取近回盲部2cm腸管分別置于中性甲醛溶液和－70℃保存。（5）觀測(cè)指標(biāo)：各組新生大鼠一般表現(xiàn)、體重變化、72h存活率、腸道病理評(píng)分、NEC發(fā)生率，采

8、用熒光定量 PCR方法檢測(cè) TLR4、TOLLIP及 SIGIRR mRNA表達(dá)并進(jìn)行組間比較。
　　結(jié)果：（1）正常組新生大鼠活力佳，叫聲響，無黏液血便和腹脹等 NEC表現(xiàn)。NEC組新生大鼠活動(dòng)少，叫聲弱，大部分出現(xiàn)黏液血便及腹脹等 NEC表現(xiàn)。干預(yù)組情況好于 NEC組但弱于正常組，出現(xiàn)腹脹、便血等 NEC表現(xiàn)較輕。（2）正常組新生大鼠72h內(nèi)體重逐漸增長(zhǎng)（ P<0.05），NEC組新生大鼠體重逐漸減輕（ P<0.05），干預(yù)組

9、體重沒有顯著改變（P>0.05）。（3）NEC組72h存活率56％（9/16），干預(yù)組87%（13/15），正常組100%，干預(yù)組與 NEC組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05）。（4）正常組、NEC組和干預(yù)組腸道病理評(píng)分分別為0分、（2.4±1.0）分和（1.3±0.6）分，干預(yù)組與 NEC比較，腸道病理評(píng)分降低（ P<0.05）。（5）正常組、NEC組和干預(yù)組 NEC發(fā)生率分別為0（0/14）、78%（7/9）和23%（3/13

10、），干預(yù)組與 NEC比較，NEC發(fā)生率降低（ P<0.05）。（6）正常組、NEC組和干預(yù)組 TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.38、3.64±1.73和1.78±0.70；TOLLIP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.85、0.23±0.15和0.86±0.62；SIGIRR mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.58、0.27±0.12和0.71±0.49。NEC組 TLR4 mRNA表達(dá)高于正常組， TOLLI

11、P以及 SIGIRR mRNA表達(dá)低于正常組（ P均<0.05）。干預(yù)組 TLR4 mRNA表達(dá)低于 NEC組，TOLLIP和 SIGIRR mRNA表達(dá)高于 NEC組（ P均<0.05），但與正常組進(jìn)行比較，TLR4、TOLLIP和 SIGIRR mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P分別為0.63、0.614和0.146）。
　　結(jié)論：早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)及缺氧冷刺激可誘導(dǎo)新生大鼠腸組織產(chǎn)生接近人類新生兒 NEC樣病理改變。NEC發(fā)生機(jī)