SiRNA介導(dǎo)的UBE2C沉默對乳腺癌MCF-7細胞株的影響.pdf

1、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與，涉及復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的過程。泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasome Pathway，UPP)異常與乳腺癌的這一過程密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明UPP途徑通過調(diào)節(jié)蛋白降解在乳腺癌的腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用。而作為泛素-蛋白酶體途徑重要組成部分的泛素偶聯(lián)酶2C(UBE2C)與乳腺癌的相關(guān)性越發(fā)受到關(guān)注。UBE2C的異常表達能通過使細胞提前終止有絲分裂、調(diào)節(jié)細胞生長相關(guān)蛋白等多種方式

2、誘導(dǎo)乳腺癌進展，因此，靶向UBE2C有望成為治療乳腺癌的新策略。然而，目前對于UBE2C基因?qū)θ橄侔┓肿诱{(diào)控的相關(guān)機制尚未明確。
　　目的:本研究以UBE2C基因為研究對象，通過采用小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的UBE2C基因觀察沉默UBE2C對人乳腺癌細胞株MCF-7增殖、凋亡及遷移活性的影響，此外，通過同時沉默UBE2C及P53基因，探討對以上生物學(xué)行為的分子機制，以期為UBE2C基因作為乳腺癌治療的靶點提供進一步理論依據(jù)。

3、
　　方法:化學(xué)合成針對UBE2C基因的siRNA-UBE2C序列及siRNA-P53序列。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA至MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染后24小時，采用Real-Time PCR及Westernblotting分別檢測UBE2C及P53mRNA水平和蛋白質(zhì)表達水平，將未進行任何處理的MCF-7細胞作為空白對照組，將轉(zhuǎn)染陰性序列的MCF-7細胞作為陰性對照組。采用siRNA-UBE2C轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，以雙轉(zhuǎn)染（siRNA-UB

4、E2C聯(lián)合siRNA-P53）細胞及未轉(zhuǎn)染細胞為對照，采用CCK8比色法對細胞的增殖進行檢測;通過流式細胞儀對細胞的凋亡進行檢測;通過劃痕實驗檢測細胞的遷移情況。
　　結(jié)果:1.Real-TimePCR檢測結(jié)果顯示:在進行轉(zhuǎn)染后的24h，沉默UBE2C組UBE2CmRNA水平與空白對照組及陰性對照組相比呈顯著下降，而相應(yīng)的P53 mRNA水平較空白對照組和陰性對照組呈上升趨勢。
　　2.Western blotting檢測結(jié)

5、果顯示:在進行轉(zhuǎn)染后的24h，沉默UBE2C組UBE2C蛋白表達水平較空白對照組及陰性對照組顯著降低，而P53蛋白水平表達較空白對照組和陰性對照組則呈上升趨勢。
　　3.Western blotting檢測結(jié)果顯示:在進行轉(zhuǎn)染后24h，沉默P53組P53蛋白表達水平較空白對照組及陰性對照組下降;沉默P53組的UBE2C蛋白表達水平較空白對照組及陰性對照組變化不大。
　　4.CCK8法檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染UBE2C基因后6h，1

6、2h，24h，沉默UBE2C組細胞增殖率明顯高于空白對照組;雙轉(zhuǎn)染組（si-UBE2C+si-P53組）增殖率高于沉默UBE2C組，低于空白對照組。
　　4.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染UBE2C基因后，沉默UBE2C組細胞凋亡率較空白對照組明顯升高;雙轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率低于沉默UBE2C組，高于空白組。
　　5.劃痕實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染UBE2C基因后，沉默UBE2C組細胞遷移能力低于空白對照組;雙轉(zhuǎn)染組細胞遷移高于沉默UBE

7、2C組，低于空白對照組。
　　結(jié)論:1.沉默UBE2C基因可以促進乳腺癌細胞MCF-7的P53基因的表達，而沉默P53基因?qū)θ橄侔┘毎鸐CF-7的UBE2C基因表達影響不大，提示UBE2C基因可能通過某種信號通路或某種基因直接或間接地調(diào)控P53基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　2.沉默UBE2C基因能夠?qū)е氯橄侔㎝CF-7細胞系凋亡的增加，增殖及遷移能力降低，提示UBE2C基因在MCF-7細胞系的凋亡、增殖及遷移方面能夠通過某種機制發(fā)