基于PGE2通路探討陳皮生物堿對(duì)肺纖維化早期干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究使用博來霉素建立C57BL/6小鼠的肺纖維化模型，原代培養(yǎng)出肺成纖維細(xì)胞，MTT法篩選出活性最強(qiáng)的陳皮生物堿，觀察陳皮生物堿對(duì)C57BL/6小鼠肺纖維化的早期干預(yù)作用，并探討其對(duì)PGE2通路的影響。
　　方法:1.將C57BL/6小鼠每組10只，隨機(jī)分成正常組和模型組，利用博來霉素制備C57BL/6小鼠肺纖維化模型，通過原代培養(yǎng)獲得小鼠的肺成纖維細(xì)胞。
　　2.將小鼠肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代，用處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺成纖

2、維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用四氮唑鹽比色法（MTT法）對(duì)陳皮生物堿在20μM濃度下進(jìn)行初篩，其次設(shè)5個(gè)濃度復(fù)篩，分別是50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM五個(gè)濃度梯度;用乳酸脫氫酶(LDH)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)陳皮生物堿對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞的毒性;篩選出活性最強(qiáng)的陳皮生物堿。
　　3.C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、博來霉素組（模型組）、陳皮生物堿高劑量組(100mg/kg)、陳皮生物堿中劑量組(50mg/kg)、陳皮生物

3、堿低劑量組(25mg/kg)、陽性對(duì)照組（強(qiáng)的松組）;正常組除外，其余各組均采用BLM（5mg/kg）氣管內(nèi)滴注制備肺纖維化模型;造模后第1天開始灌胃小鼠，每天按劑量灌胃一次，連續(xù)28天;正常組和模型組按100mg/kg生理鹽水灌胃;陳皮生物堿組按高、中、低劑量每天灌胃1次;陽性組按6mg/kg強(qiáng)的松灌服。給藥第28天時(shí)處死小鼠，取肺組織行HE染色及Masson染色觀察病理變化;按試劑盒說明檢測(cè)小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)的含量;用E

4、lisa法測(cè)血清中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)及肺組織中前列腺素E2(PGE2)的含量;蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè)肺組織中TGF-β1、COX-2及G-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體2(E-series of prostaglandinreceptor, EP2)的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.光學(xué)顯微鏡下原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)條形或梭形，平行地排列生長(zhǎng);經(jīng)波形蛋白(Vimentin)及α-平滑肌蛋白(α-S

5、MA)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定后，Vimentin及α-SMA蛋白均表達(dá)于胞質(zhì)，均呈黃棕色，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞;運(yùn)用MTT法測(cè)出肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線:48h的時(shí)候進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，72-96h為細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，120h后細(xì)胞生長(zhǎng)處于高峰期，然后進(jìn)入平臺(tái)期。
　　2.體外試驗(yàn):陳皮生物堿及其鹽對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞均有抑制作用，其中對(duì)羥基苯乙胺鹽的抑制效果最強(qiáng);LDH實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)羥基苯乙胺鹽對(duì)肺成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用是其藥物活性

6、并非其毒性。
　　3.小鼠體重變化:(1)模型組小鼠體重增長(zhǎng)速度顯著慢于正常組，并且體重比正常組有著明顯的減輕，(P＜0.01)(2)與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組及強(qiáng)的松組的體重是增加的，但沒有顯著性。
　　4.肺泡炎及肺纖維化積分:(1)模型組在肺泡炎程度及肺纖維化程度方面均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＜0.01)。(2)與模型組比較，高劑量組和強(qiáng)的松組在肺泡炎和肺纖維化程度方面均較模型組輕，差異是有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，中劑量組及低劑量組在肺泡炎方面較模型組有顯著性的減輕(P＜0.05)。
　　5.HYP含量:模型組小鼠肺組織中的HYP含量較正常組顯著性升高的(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組、中劑量組及強(qiáng)的松組小鼠肺組織中HYP含量有著顯著性下降（P＜0.05或P＜0.01）。
　　6.血清中TGF-β1含量:模型組小鼠血清中TGF-β1含量比正常組顯著增高(P＜0.01);與模型組相比，高

8、劑量組、中劑量組及強(qiáng)的松組小鼠血清中TGF-β1含量是顯著下降的(P＜0.05或P＜0.01)。
　　7.肺組織中PGE2含量:模型組小鼠肺組織中的PGE2含量和正常組比較，顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組小鼠肺組織中PGE2含量顯著增加(P＜0.05)。
　　8.Western blotting檢測(cè)結(jié)果:與正常組比較，模型組小鼠肺組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，模型組肺組織中COX-2

9、及EP2的表達(dá)與正常組比較，顯著增加(P＜0.05);高劑量組及中劑量組肺組織中的TGF-β1的蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P＜0.05)，高劑量的對(duì)羥基苯乙胺鹽可以提高小鼠肺組織中COX-2及EP2的蛋白表達(dá)，有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.用胰蛋白酶消化法可以分離出肺纖維化肺成纖維細(xì)胞，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng);并且培養(yǎng)出來的肺成纖維細(xì)胞具有肌成纖維細(xì)胞的特性，可用于肺纖維化機(jī)制的研究。
　　2.陳皮生

10、物堿在體外對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞均有較好的抑制其增殖的作用，其中對(duì)羥基苯乙胺鹽的抑制作用最好，其對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞的抑制作用是其生物活性，并非其毒性。
　　3.對(duì)羥基苯乙胺鹽能夠改善肺纖維化小鼠的癥狀及增加其體重。
　　4.對(duì)羥基苯乙胺鹽對(duì)BLM誘導(dǎo)的PF小鼠的肺泡炎及肺纖維化程度能起到一定的緩解作用。
　　5.對(duì)羥基苯乙胺鹽可以降低PF小鼠肺組織中的HYP含量，同時(shí)還可以使PF小鼠血清和肺組織中TGF-β1的含量降低，具