花青素通過調(diào)控抗氧化應(yīng)激和凋亡拮抗神經(jīng)毒性的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 花青素拮抗順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性及機(jī)制研究
　　順鉑作為一線抗腫瘤藥物被廣泛應(yīng)用于臨床上治療多種腫瘤，但因其神經(jīng)毒性等嚴(yán)重的毒副作用，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。眾所周知，順鉑能夠引起神經(jīng)毒性，氧化應(yīng)激在其中的作用仍不是很清楚。很多研究證實(shí)，順鉑依賴性的化療可引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，其機(jī)制可能涉及ROS清除障礙、產(chǎn)生和蓄積，DNA損傷、炎癥及線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡等機(jī)制?；?/p>

2、青素是一種天然的，廣泛存在的類黃酮物質(zhì)，抗氧化活性強(qiáng)。因此，我們本部分我們評價(jià)花青素體外拮抗順鉑誘導(dǎo)的的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性，并且探討其可能的機(jī)制。
　　目的：
　　研究順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性模型，探討花青素在此過程中的保護(hù)作用和機(jī)制。
　　方法：
　　PC12細(xì)胞接種至96孔板，2.5-40μM的順鉑或10-80μM的花青素處理24小時(shí)，花青素治療組在花青素預(yù)處理3小時(shí)再加順鉑。MTT的方法檢測細(xì)胞活性

3、;流式細(xì)胞儀檢測凋亡和周期分布;用TUNEL-DAPI共染色檢測染色質(zhì)濃縮和斷裂;Caspase熒光底物檢測Caspase-3活性;DCFH-DA探針檢測ROS的含量;Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)PARP、Caspase-3、Ser15-p53、Ser139-H2A等蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　花青素預(yù)處理可以顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡和改善形態(tài)學(xué)改變;TUNEL-DAPI染色發(fā)現(xiàn)花青素預(yù)處理能減輕順鉑誘導(dǎo)的細(xì)

4、胞凋亡特征;流式結(jié)果顯示花青素顯著減弱順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為Sub-G1峰的降低;機(jī)制上，花青素預(yù)處理可顯著減弱順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Caspase-3的激活和PARP的切割，抑制ROS產(chǎn)生;此外，花青素預(yù)處理顯著減弱了順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，表現(xiàn)為Ser15-p53和Ser139-H2A磷酸化水平的降低。
　　結(jié)論：
　　花青素預(yù)處理可顯著減弱順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡，證明其可以作為一種潛在的臨床藥物用于減弱腫瘤

5、化療帶來的神經(jīng)毒性。
　　第二部分 花青素拮抗Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的機(jī)制研究
　　Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷被認(rèn)為是阿爾茨海默病的主要病生特點(diǎn)，Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷產(chǎn)生ROS的積蓄，蛋白損傷、細(xì)胞膜磷脂和DNA破壞，最終，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，神經(jīng)功能缺失。抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷被認(rèn)為是對抗AD的有效治療措施。有著抗氧化損傷活性的各類藥物，應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病治療的時(shí)候有很大潛力。有實(shí)驗(yàn)證明花青素可以清除機(jī)體產(chǎn)生的過量ROS，并拮抗R

6、OS引起的DNA損傷，能有效對抗氧化損傷介導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變。然而這一藥理學(xué)作用的具體機(jī)制尚不清楚，因此我們研究了花青素對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護(hù)作用并其可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　目的：
　　成立Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，探討花青素在此過程中的作用。
　　方法：
　　PC12細(xì)胞接種至96孔板，Aβ25-35用PBS溶解并37℃孵育3天，花青素(20，40，80μM)預(yù)處理24 h后加Aβ(1

7、0μM)共處理24h。MTT法測細(xì)胞活存活能力，TUNEL-DAPI共染法染核，觀察DNA分裂。JC-1探針法檢測線粒體膜電位(△ψm)，采用Ac-DEVD-AMC底物檢測Caspase-3活性，ROS蓄積用DCFH-DA法分析使用MD m5e酶標(biāo)儀檢測。Westernblot法檢測Bax，Bcl-2，Ser139-H2A，p53等蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　花青素可以顯著減少了Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡;花青素預(yù)處理顯著減

8、弱Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為染色質(zhì)斷裂和濃縮的減弱、Caspase-3活性的降低和Caspase-3切割的減弱;western blot和JC-1結(jié)果表明:花青素預(yù)處理可通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)線粒體膜電位;此外，花青素預(yù)處理通過減弱自由基的產(chǎn)生，顯著減弱了Aβ誘導(dǎo)的DNA損傷，表現(xiàn)為Ser15-p53和Ser139-H2A磷酸化水平的下降。
　　結(jié)論：
　　從機(jī)制上講，花青素通過影響B(tài)cl-2家族蛋白含量的變

9、化、穩(wěn)定線粒體膜電位，從而有效阻斷了Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。此外，花青索還通過抑制ROS的生成和大量蓄積而防止PC12細(xì)胞因暴露于Aβ而導(dǎo)致的DNA損傷。均提示花青素可以作為一種藥物用于預(yù)防和治療氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)毒性損傷，具有作為一種有效治療或延緩臨床常見神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程的巨大潛力。
　　第三部分 花青素對光化學(xué)法誘導(dǎo)的小鼠局灶性腦缺血模型的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　缺血性卒中通過氧化應(yīng)激這一機(jī)制導(dǎo)致了神經(jīng)損傷。很多

10、研究證實(shí)，腦缺血引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與缺血引起機(jī)體應(yīng)激導(dǎo)致的過氧化損傷后ROS清除障礙、產(chǎn)生和蓄積過多進(jìn)一步引起DNA損傷、炎癥及線粒體功能障礙從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)。主要組分為類黃酮的花青素抗氧化能力極強(qiáng)，因此，我們研究花青素對缺血性腦卒中引起的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用并且探討其可能的機(jī)制。
　　目的：
　　建立光化學(xué)法誘導(dǎo)的小鼠局灶性腦缺血模型，探討花青素預(yù)處理在此過程中的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　M

11、oor多普勒檢測局部腦血流量、進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分、評估腦功能損傷情況輕重，測定梗死體積;TUNEL-DAPI共同染凋亡，腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)含量如ROS、SOD、MDA的含量熒光探針及比色法采用用多功能酶標(biāo)儀檢測，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)PARP、Caspase-3、HO-1、Nrf-2等蛋白含量。
　　結(jié)果：
　　花青素預(yù)處理可以顯著增加成模小鼠局部腦血流量，改善腦缺血小鼠神經(jīng)功能及行為學(xué)評分，梗死體積縮小。TUN

12、EL和DAPI染色發(fā)現(xiàn)花青素預(yù)處理能減輕腦缺血小鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的特征表達(dá)，減輕了Caspase-3激活和PARP分裂;顯著抑制ROS的生成降低了MDA的含量，SOD含量增加，HO-1、Nrf-2蛋白表達(dá)水平增高。
　　結(jié)論：
　　花青素預(yù)處理對局灶性腦缺血小鼠腦組織具有明顯的保護(hù)作用，其主要機(jī)制可能與花青素預(yù)處理減少ROS蓄積及脂質(zhì)過氧化，機(jī)體的抗氧化損傷機(jī)能加強(qiáng)，DNA損傷減弱，而且顯著抑制了細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)。可見花