蠟梅非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因nsLTP家族成員克隆及其抗逆功能分析.pdf

1、植物非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTP)是一類(lèi)廣泛存在于高等植物中的堿性小分子蛋白，編碼nsLTP的基因在許多植物中都以基因家族的形式存在，如擬南芥、大麥等。nsLTP成員具有不同的生物學(xué)功能，主要涉及角質(zhì)合成，用以調(diào)節(jié)脂質(zhì)儲(chǔ)藏的分解代謝的β氧化、體細(xì)胞胚胎形成、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與植物有性生殖、花粉發(fā)育、對(duì)病原物的防御以及對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答等。明確不同成員在植物抗性形成方面的作用，對(duì)于調(diào)控植物抗性和利用基因工程改良植物抗性有重要意義。

2、本文克隆得到了蠟梅脂轉(zhuǎn)移基因家族4個(gè)成員，并進(jìn)行了啟動(dòng)子分離工作，利用生物信息學(xué)、熒光定量PCR、原核表達(dá)等方法對(duì)獲得的蠟梅脂轉(zhuǎn)移蛋白基因家族成員抗逆性的差異進(jìn)行了分析。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴在已構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫(kù)及EST分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)文庫(kù)cDNA克隆全長(zhǎng)測(cè)序，得到了4個(gè)編碼蠟梅非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因(nsLTP)，分別命名為CpLTP1，CpLTP2，CpLTP3和CpLTP4，GenBank登錄號(hào)為

3、FJ889521，F(xiàn)J904082，F(xiàn)J904083和FJ904084。它們的cDNA全長(zhǎng)分別為611、1016、656和1997 bp，ORF分別為360、360、351和660 bp，無(wú)內(nèi)含子，5’和3’端的非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度不等，存在的調(diào)控基序有所不同。運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)蠟梅nsLTP基因家族4個(gè)成員編碼蛋白CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3和CpLTP4的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)進(jìn)行了分析，CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3具有

4、明顯的植物脂轉(zhuǎn)移蛋白nsLTPI類(lèi)的特征，分子量都為9KD，含有保守的4個(gè)螺旋區(qū)、8個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)和脂質(zhì)結(jié)合基序，具有明顯的信號(hào)肽序列，定位于細(xì)胞外的可能性最高，進(jìn)一步的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也顯示能夠形成管狀的疏水腔。而CpLTP4與其他3個(gè)編碼蛋白顯著不同，具有較高的分子量(19.7KD)，雖然同樣具有8個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，但第8個(gè)位點(diǎn)的位置與nsLTPI類(lèi)有一定的差異，細(xì)胞定位有所不同，定位于質(zhì)膜的可能性最高，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示形成上寬下窄

5、的類(lèi)似于三角形的疏水腔，聚類(lèi)分析時(shí)與同樣高分子量的剛毛怪柳、蓖麻等的脂轉(zhuǎn)移蛋白聚在一支，這種高分子量的脂轉(zhuǎn)移蛋白有可能形成一個(gè)新的類(lèi)別。
　　 ⑵功構(gòu)建LTP1—pET、LTP2—pET、LTP3—pET、LTP4—pET原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Origami(DE3)表達(dá)菌株，通過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，在28℃、0.5m MIPTG、誘導(dǎo)6h能夠獲得較好的可溶性表達(dá)。利用His—Bind蛋白純化回收試劑盒獲得4個(gè)純化的重組蛋白。體外抑菌試驗(yàn)

6、結(jié)果表明，4個(gè)重組蛋白都具有抑菌活性但有差異，其中LTP4重組蛋白抑制小麥赤霉菌生長(zhǎng)的能力最強(qiáng)，LTP1最弱。對(duì)于細(xì)菌的抑制活性還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 ⑶對(duì)蠟梅植株進(jìn)行低溫、干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)處理，利用熒光定量PCR技術(shù)分析蠟梅nsLTP基因家族4個(gè)成員在蠟梅葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，4個(gè)nsLTP基因在蠟梅幼苗中的表達(dá)受干旱、ABA、低溫和NaCl處理的影響程度不同。CpLTP1、CpLTP2，CpLTP3基因在脅

7、迫處理下表達(dá)總體下調(diào)，而CpLTP4基因在脅迫處理下表達(dá)總體上調(diào)，其中在低溫處理下表達(dá)量最高。結(jié)果表明雖然CpLTP1，CpLTP2，CpLTP3基因來(lái)自于同一基因家族，但其功能上具有明顯的差異，可能在蠟梅幼苗的水分平衡、耐受低溫、離子代謝等過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用，CpLTP4基因可能對(duì)蠟梅抵抗非生物脅迫起更重要的作用。
　　 ⑷利用hiTAIL—PCR法分離分別得到了CpLTP3，CpLTP4基因5’端上游的一段長(zhǎng)1298bp

8、和838bp的序列，二者的序列差異較大，Identity值為27.75％。經(jīng)序列測(cè)定及軟件分析表明，這兩個(gè)序列具有典型的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，除含有TATA—box、CAAT—box等啟動(dòng)子基本元件，另外都含有較多的光應(yīng)答元件、與植物非生物脅迫相關(guān)的一些響應(yīng)元件，如ABRE、G—BOX、HSE。僅在CpLTP4pro發(fā)現(xiàn)GARE—motif、TATC—box、MBS、TC—rich repeats，在CpLTP3pro啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)

9、的順式調(diào)控元件MSA—like和胚乳表達(dá)必須的順式調(diào)控元件Skn—1_motif。將克隆得到的蠟梅啟動(dòng)子CpLTP3pro、CpLTP4pro代替pBI121中的CaMV35S啟動(dòng)子構(gòu)建成適于瞬時(shí)表達(dá)研究的植物表達(dá)載體pBI12l—CpLTP3pro和pBI121—CpLTP4pro。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)研究，在GA3誘導(dǎo)下，CpLTP4pro能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草葉片中的表達(dá)，而CpLTP3pro不能。在CpLTP3pro、Cp