沙蟾毒精及其代謝物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用和藥代動力學(xué)研究.pdf

1、目的:本課題研究內(nèi)容分為三部分:第一部分是沙蟾毒精誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究。第二部分是沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物1β-羥基-沙蟾毒精對肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究。第三部分是沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)和組織分布研究。
　　方法:(1)MTT法測定沙蟾毒精對A549細(xì)胞抑制率，測定IC50值。采用倒置顯微鏡、Hochest33342染色實驗觀察沙蟾毒精處理A549細(xì)胞后所發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變，檢測“凋亡

2、小體”;采用AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞法觀測細(xì)胞凋亡比例。PI單染流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期的變化。
　　(2)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠尿液，膽汁和糞便中沙蟾毒精的濃度，研究沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的排泄動力動力學(xué)特點。同時運用LC-MS分析技術(shù)和Lightsight計算機軟件處理數(shù)據(jù)，初步推測沙蟾毒精在大鼠膽汁、尿液、糞便和血漿的代謝產(chǎn)物及其代謝通路。MTT法測定1β-羥基-沙蟾毒精對A549細(xì)胞抑制率，測定IC50值。

3、采用倒置顯微鏡、Hochest33342觀察1β-羥基-沙蟾毒精處理A549細(xì)胞后所發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變;采用AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞法觀測細(xì)胞凋亡。PI單染流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期的變化。PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別檢測了A549細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR信號通路、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9基因和蛋白的變化。劃痕試驗和Transwell小室試驗觀察細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　

4、(3)超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠血漿及組織中沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精的濃度，研究沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)過程及組織分布特點，獲得主要的藥動學(xué)參數(shù)Tmzx、Cmax、t1/2、 MRT0-t、AUC0-t、AUC0-∞，闡明沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精組織分布規(guī)律。
　　結(jié)果:(1)沙蟾毒精能夠抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長，A549細(xì)胞經(jīng)過沙蟾毒精處理后，細(xì)胞生長受到明顯受抑制，增殖速度明顯減弱，細(xì)胞相互分

5、散，A549細(xì)胞出現(xiàn)了突起短縮，細(xì)胞逐漸由梭狀變成橢圓形或圓形，體積變小、胞質(zhì)皺縮減少，固縮且深染，折光性變差。細(xì)胞中可以見到很多空泡狀改變現(xiàn)象，部分細(xì)胞脫離貼壁生長狀態(tài)，成為懸浮細(xì)胞。且呈現(xiàn)劑量依賴性，其IC50值為431nM。Hoechst33342熒光染色實驗可看到邊集的細(xì)胞不斷增加，細(xì)胞核高度固縮、凝聚，出現(xiàn)“凋亡小體”。G2/M期細(xì)胞百分率顯著增加（F=71.54，P＜0.001），G1期細(xì)胞百分率顯著降低（F=25.99，P

6、＜0.001）。隨著沙蟾毒精濃度的增加，G2/M期細(xì)胞所占比例明顯增加，并且具有統(tǒng)計學(xué)意義。AnnexinⅤ-PI雙染結(jié)果顯示沙蟾毒精可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，且隨著沙蟾毒精濃度的增加A549細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)的增加(F=111.1，P＜0.001)。
　　(2)①測定膽汁、尿液和糞便中的沙蟾毒精的線性范圍為5.280-1056ng/mL(膽汁或尿液)和10.56-1056 ng/g(糞便)，定量下限分別為5.280 ng/mL(

7、膽汁或尿液)和10.56 ng/g(糞便)。膽汁、尿液和糞便日內(nèi)精密度分別為4.8％～9.5％、7.1％～9.3％和7.1％～11.0％，日間精密度分別為5.7％～10.0％、3.9％12.2％和5.1％～10.6％，準(zhǔn)確度分別為-2.0％～1.6％、-2.1％～1.6％和-0.6％～4.3％。SD大鼠給藥4.0mg/kg后，原形藥物經(jīng)膽汁、尿液和糞便途徑24h累積排泄量占總給藥量的百分比分別為:2.301％、19.67％和1.726％

8、，三者的總排泄率為23.70％;三者的t1/2分別為1.66±0.07 h、2.54±0.78 h和5.87±1.22 h。在大鼠體內(nèi)鑒定出沙蟾毒精的24種代謝物。其中膽汁中鑒定了17個代謝物，尿液中發(fā)現(xiàn)了16個代謝物，糞便中發(fā)現(xiàn)了10個代謝物，血漿中發(fā)現(xiàn)18個代謝物，包括Ⅰ相代謝產(chǎn)物和Ⅱ相代謝產(chǎn)物，所涉及的代謝反應(yīng)有:異構(gòu)化、氧化、還原、甲基化、與硫酸結(jié)合、與葡萄糖醛酸結(jié)合。②A549細(xì)胞經(jīng)用不同濃度1β-羥基-沙蟾毒精處理后，細(xì)胞生

9、長受到了明顯抑制，增殖速度明顯減弱，細(xì)胞間相互分散，細(xì)胞逐漸由梭狀變成橢圓形或圓形，體積變小、固縮且深染，折光性差。細(xì)胞透明度下降，細(xì)胞中出現(xiàn)了很多空泡狀改變現(xiàn)象，部分細(xì)胞脫離貼壁生長狀態(tài)，成為懸浮細(xì)胞。且呈劑量依賴性，其IC50值為208nM。Hoechst33342染色實驗可看到邊集細(xì)胞不斷增加，細(xì)胞核高度固縮、凝聚，出現(xiàn)了“凋亡小體”。PI單染結(jié)果顯示，G2/M期細(xì)胞百分比顯著增加(F=46.87，P＜0.001)，G1期細(xì)胞百分

10、比顯著降低(F=26.76，P＜0.001)。隨著1β-羥基-沙蟾毒精濃度的增加，G2/M期細(xì)胞所占比例明顯增加，并且具有統(tǒng)計學(xué)意義。AnnexinⅤ-PI雙染結(jié)果顯示1β-羥基-沙蟾毒精可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，且隨著1β-羥基-沙蟾毒精濃度的增加A549細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)的增加。Western Blot和PCR結(jié)果均表明，1β-羥基-沙蟾毒精可下調(diào)PI3K/Akt/m-TOR和Bcl-2的蛋白表達和mRNA水平;而上調(diào)Bax、Cas

11、pase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白表達水平，由此來增加Bax/Bcl-2比值。劃痕試驗和Transwell小室試驗表明，1β-羥基-沙蟾毒精能夠顯著降低549細(xì)胞的遷移率(F=78.86，P＜0.001)和侵襲率(F=57.13，P＜0.001)，隨著濃度的增大抑制作用增強。
　　(3)健康SD大鼠腹腔注射給予低、中、高三個劑量沙蟾毒精后，血漿中沙蟾毒精的Tmax分別為12.5±2.7 min、11.7±2.6 mi

12、n和11.7±2.6 min; Cmax分別為1078±182.6 ng/mL、1981±566.5 ng/mL和4373±1354 ng/mL; t1/2分別為103.8±40.43min、113.0±47.02 min和110.3±21.17 min; MRT0-t分別為:45.6±6.8min、38.6±9.6 min和42.7±10.5min;用梯形法計算，AUC0-t分別為39.56±11.10mg·min/L、79.67±2

13、6.06 mg·min/L和166.7±57.96 mg·min/L; AUC0-∞分別為39.63±11.14 mg·min/L、79.78±26.11 mg·min/L和166.9±57.80 mg·min/L。血漿中的1β-羥基-沙蟾毒精Tmax分別為59.28±7.319min，47.5±6.124min，47.50±6.124min;Cmax分別為125.48±15.31 ng/mL，206.3±79.88 ng/mL，390

14、.1±111.3 ng/mL; t1/2分別為113.8±37.48min，106.3±39.42min，123.8±47.43min; MRT0-t分別為98.21±22.34min，85.75±18.29min，95.88±11.94 min;用梯形法計算，AUC0-t分別為7.192±2.142 mg·min/L，13.43±3.945 mg·min/L，26.47±8.460 mg·min/L，AUC0-∞分別為7.271±2.

15、187 mg·min/L，13.46±3.958mg·min/L，26.67±8.542 mg·min/L。沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精的Cmax和AUC與給藥劑量呈良好的相關(guān)性。健康SD大鼠單劑量腹腔注射給藥沙蟾毒精4.0 mg/kg后，沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精在心、肝、脾、肺、腎和腦等組織均有分布，沙蟾毒精在5.0 min或15 min時達到峰值，而1β-羥基-沙蟾毒精在45 min或60 min。給藥15 min后，沙蟾毒

16、精和1β-羥基-沙蟾毒精主要分布于腎臟、肝臟和肺，表明腎臟和肝臟是其排泄和代謝的主要器官，同時腎臟、肝臟和肺臟也是其作用的靶器官。給藥45 min后能在腦和睪丸中檢出沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精的含量，表明該藥物能透過血腦和血睪屏障。
　　結(jié)論:沙蟾毒精能抑制肺癌A549細(xì)胞的生長及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，呈劑量依賴性。排泄動力學(xué)結(jié)果表明沙蟾毒精其原型主要通過尿液途徑排泄，隨尿液、膽汁和糞便途徑24 h累積排泄

17、量占總給藥量為23.43％。體內(nèi)代謝研究表明，沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的代謝主要是通過Ⅰ相代謝的氧化反應(yīng)和Ⅱ相代謝的與硫酸或葡萄糖醛酸結(jié)合的反應(yīng)來完成，產(chǎn)生包括1β-羥基-沙蟾毒精在內(nèi)的24種代謝產(chǎn)物。1β-羥基-沙蟾毒精能抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。1β-羥基-沙蟾毒精能誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡，阻滯A549細(xì)胞周期于G2/M期。其誘導(dǎo)凋亡機制可能為:①抑制PI3K/Akt/ mTOR信號通路，降低通路中相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯;

18、②增加A549細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值，促進凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而促進肺癌細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生一定的抗肺癌作用。通過藥物動力學(xué)研究，獲得沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、 MRT0-t、AUC0-t和AUC0-∞等。Cmax和AUC0-∞與給藥劑量呈良好的線性相關(guān)。沙蟾毒精和1β-羥基-沙蟾毒精能迅速并廣泛的分布于各個組織，肝臟、腎臟和肺是主要分布器官，