哈薩克藥材別克參多糖分離純化、抗炎免疫活性及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)提取、分離、純化獲得別克參均一多糖，對(duì)均一多糖理化性質(zhì)及一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，為別克參藥材物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)；考察別克參多糖體內(nèi)、體外免疫調(diào)節(jié)及抗炎活性，為該藥材生物活性研究提供理論支持；建立別克參藥材質(zhì)量控制方法，保證該藥材臨床用藥的安全、有效、可控、穩(wěn)定。
　　方法：①運(yùn)用響應(yīng)曲面法及四因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化別克參多糖成分的熱水提取工藝，通過(guò)DEAE Sepharose CL-6

2、B和Sephadex G-100對(duì)提取后的粗多糖進(jìn)行分離純化，采用高效凝膠色譜法分析純化后均一多糖的純度及相對(duì)分子質(zhì)量；②運(yùn)用苯酚-硫酸法、間羥聯(lián)苯法、碘顯色法、柱前衍生-HPLC法測(cè)定別克參均一多糖中總糖含量、糖醛酸、淀粉含量及單糖組成；結(jié)合紅外、Smith降解、甲基化實(shí)驗(yàn)、部分酸水解及NMR分析初步鑒別均一多糖的結(jié)構(gòu)；③通過(guò)小鼠體內(nèi)碳粒廓清實(shí)驗(yàn)考察別克參粗多糖對(duì)免疫低下小鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)功能；通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹、小鼠棉球肉芽腫

3、及冰醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)考察別克參粗多糖抗炎鎮(zhèn)痛功效；通過(guò)測(cè)定別克參多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性、吞噬能力、分泌細(xì)胞因子及介質(zhì)能力的影響，考察體外免疫調(diào)節(jié)能力；通過(guò)測(cè)定別克參多糖組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子及介質(zhì)的影響，考察體外抗炎能力；④藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究：分析10批別克參藥材中水分、灰分；建立微波消解ICP-MS法測(cè)定別克參中微量元素、重金屬含量的方法；建立乙腈超聲萃取、GC-MS法分析別克參藥材中農(nóng)藥殘

4、留的方法；建立別克參藥材中氨基酸成分、多糖成分的薄層鑒別方法；建立柱前衍生-HPLC法測(cè)定藥材中多糖含量的方法。
　　結(jié)果：①響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的別克參粗多糖提取工藝為：提取時(shí)間4.28 h，提取溫度90℃，料液比37 ml/g，提取次數(shù)3次。驗(yàn)證試驗(yàn)所得產(chǎn)率（37.25％±0.17%）與回歸模型預(yù)測(cè)值37.465%吻合。別克參粗多糖經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B和Sephadex G-100分離純化后，得4個(gè)均一多糖（

5、ESBP1-1、ESBP1-2、ESBP2-1、ESBP3-1），高效凝膠色譜法表明分子量分別為1.3×104、1.7×104、9.4×105、4.1×105 Da。②苯酚-硫酸法結(jié)果表明ESBP1-1、ESBP1-2、ESBP2-1、ESBP3-1總糖含量分別為97.8%、98.7%、99.3%、97.0%；間羥聯(lián)苯法結(jié)果表明ESBP2-1、ESBP3-1糖醛酸含量分別為0.02%、1.9%，ESBP1-1、ESBP1-2中不含糖醛酸

6、；碘顯色法結(jié)果表明ESBP1-1、ESBP1-2含淀粉分別為0.5%、0.3%，ESBP2-1、ESBP3-1中未檢出淀粉；柱前衍生-HPLC法結(jié)果表明ESBP1-1、ESBP1-2均由葡萄糖組成，ESBP2-1主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成（摩爾比24.3∶1.1∶1），ESBP3-1主要由葡萄糖和半乳糖組成（摩爾比14.8∶1）；紅外、Smith降解、甲基化實(shí)驗(yàn)、部分酸水解及NMR分析結(jié)果表明別克參4種均一多糖的結(jié)構(gòu)具有共性，4

7、種均一多糖主鏈均由(1→4)-α-D-Glcp構(gòu)成，均從6-O位上分支出側(cè)鏈，4種均一多糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)存在不同。③小鼠體內(nèi)碳粒廓清實(shí)驗(yàn)表明別克參粗多糖具有提高免疫抑制小鼠臟器指數(shù)及單核巨噬細(xì)胞廓清指數(shù)的能力，提示別克參多糖具有一定非特異性免疫調(diào)節(jié)功能；二甲苯致小鼠耳腫脹、小鼠棉球肉芽腫及冰醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)表明別克參粗多糖具有明顯抑制耳腫脹、降低肉芽質(zhì)量，減少扭體次數(shù)的能力，提示別克參多糖具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛功效；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，別克參粗多糖

8、ESBP及均一多糖ESBP1-1、ESBP1-2、ESBP2-1及ESBP3-1能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖，提高其吞噬活力，上調(diào)NO、IL-1β及TNF-α的釋放，顯現(xiàn)免疫增強(qiáng)作用；LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明別克參多糖可抑制由LPS誘導(dǎo)的過(guò)度免疫而產(chǎn)生的NO、IL-1β、TNF-α的分泌，顯現(xiàn)抗炎效果。④質(zhì)量控制方法研究：建立了別克參藥材中微量金屬元素、農(nóng)藥殘留的檢查方法，建立了別克參藥材中氨基酸成分、多糖成分

9、的薄層鑒別方法，建立了藥材中多糖成分的含量測(cè)定方法，完成藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案及起草說(shuō)明的撰寫。
　　結(jié)論：①運(yùn)用響應(yīng)曲面法提取別克參多糖，建立的模型準(zhǔn)確可靠，可以用于別克參多糖的提取工藝；②運(yùn)用DEAE Sepharose CL-6B和Sephadex G-100分離純化別克參粗多糖，方法可行；純化出4種均一多糖，4種均一多糖主鏈結(jié)構(gòu)具有共性；③別克參多糖組分具有增強(qiáng)免疫力的功效，可能與別克參多糖可促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)吞噬能力及上調(diào)細(xì)胞