納豆芽孢桿菌分離及納豆激酶活性的研究.pdf

1、納豆是日本的一種傳統(tǒng)食品，具有很高的營養(yǎng)價值，其主要的活性成分--納豆激酶具有顯著的溶解血栓的功能。納豆激酶作為一種新型的溶栓藥物，與目前臨床上常用的治療血栓的藥物鏈激酶、尿激酶比較，克服副作用大、體內(nèi)半衰期比較短、價格昂貴等局限性，具有安全性高、可口服、溶栓效率高、藥效時間長等突出優(yōu)點，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本文主要是對篩選出的納豆芽孢桿菌菌株展開生理學(xué)的相關(guān)研究，探討納豆芽孢桿菌的蛋白酶特性、納豆芽孢桿菌中納豆激酶的分離及不同理化

2、因子對液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響，為進一步的研究提供理論依據(jù)。
　　 本文首先分離納豆芽孢桿菌。因待分離菌株為納豆枯草芽孢桿菌，而納豆枯草芽孢桿菌具有耐鹽耐熱的特性，故將經(jīng)高溫處理的納豆菌菌懸液稀釋涂布于高鹽培養(yǎng)基上進行目的菌株的初篩，選擇具有芽孢桿菌特征的革蘭氏陽性菌株，將初篩菌株點種于脫脂牛奶培養(yǎng)基進行復(fù)篩。最終由納豆菌粉中獲得1株菌株，命名為BN；由自制納豆中獲得5株菌株，分別命名為BN-1、BN-2、BN-3、BN-4、B

3、N-5。對這6株菌株進一步進行生理生化鑒定試驗，鑒定出這6株納豆菌均分屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）種。
　　 對納豆芽孢桿菌蛋白酶的特性進行了一系列的研究。篩選得到的6株菌株均具有產(chǎn)蛋白酶的能力。在pH值、溫度、金屬離子等理化條件對BN-4菌株蛋白酶活性影響的試驗中發(fā)現(xiàn)：納豆芽孢桿菌BN-4菌株蛋白酶活力在pH6.0～10.0范圍內(nèi)變化不大，pH低于5.0和高于10.0時酶活力顯著下降；納豆芽孢桿菌BN

4、-4菌株蛋白酶作用的最適溫度為40℃，溫度對蛋白酶活力的影響顯著；5mmol/L終濃度的金屬離子Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+對納豆芽孢桿菌BN-4蛋白酶活力有明顯的抑制作用，抑制率分別為97％、83％、87％、99％，而終濃度為5mmol/L的K+對蛋白酶活力有激活作用，含K+5mmol/L的BN-4菌株粗酶液蛋白酶活力是空白粗酶液蛋白酶活力的125％。
　　 硫酸銨飽和沉淀法分離納豆芽孢桿菌BN-5菌株粗酶液中的納豆

5、激酶，可先向粗酶液中加適量的硫酸銨至30％硫酸銨飽和度，4℃8000r/min離心20min，棄沉淀；向上清液中繼續(xù)加適量硫酸銨至70％的硫酸銨飽和度，4℃8000r/min離心20min，棄上清，沉淀即為初步分離得到的納豆激酶。
　　 用試管定量法分別測定了分離得到的6株納豆芽孢桿菌菌株粗酶液中的納豆激酶的纖溶活力，BN、BN-1、BN-2、BN-3、BN-4、BN-5菌株納豆激酶纖溶活力分別為：38.07μg·min-1·m

6、l-1、72.5μg·min-1·ml-1、150.06μg·min-1·ml-1、55.70μg·min-1·ml-1、46.9μg·min-1·ml-1、49.4μg·min-1·ml-1。
　　 為確定納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的最佳條件，以普通發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別改變培養(yǎng)基的成分及含量，考察培養(yǎng)基組成對納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活力的影響：分別改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等，考察培養(yǎng)條件對納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激