miRNA在脊髓發(fā)育及腫瘤分類中的作用.pdf

1、microRNA(miRNA)是一種大小約21～23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈：RNA前體(pre-miRNA)經過Dicer酶加工而成，在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動物都有發(fā)現(xiàn)。近年來，隨著對miRNA在生物個體發(fā)育過程中的基因表達調控作用的認識，使得miRNA的研究倍受關注，并成為當前生命科學理論和應用研究的熱點。在理論方面，重點研究miRNA如何通過參與轉錄后基因表達的調控，在細胞分化、增

2、殖和死亡、發(fā)育調控等方面發(fā)揮作用；在應用方面，以miRNA為靶向的小分子RNA藥物正在成為生物藥物開發(fā)新熱點，而組織特異性miRNA表達譜有可能成為腫瘤診斷、分級、分類與預后的新標志。 一、miRNA在胚胎脊髓發(fā)育中作用機制的研究。 目的：篩選并鑒定胚胎脊髓組織中特異性miRNA，分析其在脊髓神經細胞分化、增殖和發(fā)育過程中的基本功能，為深入研究胚胎神經系統(tǒng)正常發(fā)育和畸形形成機制提供基礎。 方法：首先應用寡核

3、苷酸芯片技術分析人12孕周和24孕周流產胎兒不同器官的全基因組miRNA表達譜，通過Northern Blot和聚類分析確定脊髓等中樞神經系統(tǒng)特異性miRNA：通過全反式維甲酸(RA)誘導建立大鼠胚胎脊柱裂動物模型，根據大鼠胚胎發(fā)育情況，分別在第13.5、15.5、17.5和19.5天取出胚胎，采用miRNA組織細胞原位雜交和Northern Blot等方法檢測脊髓發(fā)生過程中miRNA的表達情況，分析脊髓組織特異miRNA在神經細胞分化

4、、增殖和發(fā)育中的作用。 結果：(1)分別構建了12周和24周人胚心臟、肝、腎、肺、腦、脊髓等組織器官的全基因組miRNA表達譜，結果顯示158種人源mi=RNA的72％.83％在胚胎組織器官中表達，且相同發(fā)育階段的不同組織器官miRNA表達譜不同，而不同發(fā)育階段的相同組織器官，miRNA表達譜也不同；通過聚類分析，首次發(fā)現(xiàn)mir-9/9<'*>僅在人胎兒神經系統(tǒng)中表達，包括大腦和脊髓，以及miR-124a、miR-125b和m

5、iR-128等三種與mir-9/9<'*>協(xié)同表達的胚胎神經系統(tǒng)特異miRNA。(2)在RA誘導的脊柱裂大鼠脊髓細胞凋亡明顯增加，表明RA處理可誘導胚胎發(fā)育晚期脊髓細胞的非正常死亡；Bcl-2與miR-9D*以及P53與miR-124a/125b具有相同的時空表達模式；且運動神經元和背根神經節(jié)中miR-124a/125b表達缺失。 結論：(1)本論文在大腦、脊髓等人胚胎神經系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)了獨特的miRNA表達譜，提示miRNA在

6、人胚胎大腦和脊髓發(fā)育過程中起重要作用。(2)本論文發(fā)現(xiàn)，RA誘導脊髓特異性miRNA表達下調主要為時空表達模式的失調，提示這些miRNA有可能通過RA誘導下調，進而影響脊髓的正常發(fā)育或誘導了細胞凋亡；此外，本研究結果還顯示miR-9/9<'*>和miR-124a/125b可能通過調控Bcl-2和。P53通路，在感覺和運動神經元發(fā)育過程中發(fā)揮作用。 二、miRNA用于神經膠質細胞瘤和視網膜母細胞瘤分類研究。 目的：以神

7、經膠質細胞瘤和視網膜母細胞瘤為對象，篩選并構建腫瘤組織特異性miRNA表達譜，研究其作為腫瘤分級、分類及預后分子標志的可行性。 方法：根據WHO臨床分級標準收集新鮮的神經膠質細胞瘤和視網膜母細胞瘤樣本，通過福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)制作組織芯片(TMA)，采用miRNA芯片、組織細胞原位雜交(ISH)和Northern Blot等方法確定腫瘤組織miRNA表達特征，采用免疫組織化學方法檢測腫瘤相關蛋白標記，包括Ki-6

8、7、VEGF和GFAP等在腫瘤組織的定位與表達情況，通過聚類分析構建腫瘤組織miRNA特異性表達譜。 結果：(1)對神經膠質細胞瘤組織miRNA表達特征的研究結果顯示，人神經膠質細胞瘤中miR-9和miR-21表達的增加，而miR-124a、miR-125b表達的減少，結合病理診斷，發(fā)現(xiàn)組織特異性miRNA表達模式與神經膠質細胞瘤的病理分級相關；此外，miRNA總體表達水平與Ki-67、VEGF以及GFAP標志物之間呈負相關。

9、(2)對視網膜母細胞瘤組織miRNA表達特征研究結果顯示，腫瘤組織基因組miRNA整體表達水平高于正常對照，有11種miRNA表達水平超過正常視網膜組織的2倍(N/T<0.5)，其中表達水平高于正常水平4倍的有miR.373<'*>、miR-503和miR-320；該結果與Northern Blot和組織細胞原位雜交結果一致。 結論：(1)根據本論文對神經膠質細胞瘤組織miRNA表達特征的研究結果表明，miRNA是一類不同于現(xiàn)

10、有腫瘤標志物的新型分級、分類標志物，同時結合臨床病程、病理診斷以及聚類分析，提示神經膠質細胞瘤組織miRNA表達特征也可用于預后以及放、化療敏感性或耐藥性的判定，并特別提出miR-9、miR-21、miR-124a和miR-125b可能是神經膠質瘤診斷、治療和預后評估的關鍵標志物。(2)在對視網膜母細胞瘤組織miRNA表達特征的研究中，首次發(fā)現(xiàn)腫瘤基因組miRNA整體表達水平增高，提示視網膜母細胞瘤的發(fā)病機制可能與其他實體瘤不同，其中m