基于鏈親和素四聚體的特性體外組裝寡聚體重組MBL蛋白.pdf

1、天然免疫是機體識別病原微生物，抵御病原體感染的第一道防線。甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-bindinglectin，MBL)是天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子，為肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白，屬C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員。MBL籍其模式識別作用選擇性識別多種病原體的糖結(jié)構(gòu)，然后通過激活補體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能，并能與吞噬細(xì)胞膠凝素受體結(jié)合而啟動調(diào)理吞噬，還可介導(dǎo)MBL依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。而且，MB

2、L也是一個重要的粘膜表面防御分子。 成熟MBL肽鏈自N端至C端依次有4個結(jié)構(gòu)域：富含Cys的N端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，CLR)、頸區(qū)和C端糖識別域(carbohydrate-recognitiondomain，CRD)。完整MBL分子是同質(zhì)三肽鏈亞單位的寡聚體，多至六聚體。只有高寡聚體MBL分子才具有生物學(xué)活性。CRD是MBL分子的識別功能區(qū)，能選擇性識別多種病原體的糖結(jié)構(gòu)；而CLR是其效應(yīng)功能區(qū)

3、，MBL結(jié)合MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineproteases，MASP1、MASP2)和膠凝素受體的功能定位于此區(qū)。在CRD識別、結(jié)合病原微生物的糖結(jié)構(gòu)后，可活化MASP酶原而激活補體凝集素途徑，并能與吞噬細(xì)胞膠凝素受體結(jié)合啟動調(diào)理吞噬，從而發(fā)揮天然抗感染免疫效應(yīng)。 獲取足量的有生物學(xué)活性的MBL蛋白是開展MBL研究的前提。但人血清中MBL含量甚微(約1mg／L)，提取困難且費用高昂，同時由于MB

4、L蛋白結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，真核表達的產(chǎn)量很低，而原核表達系統(tǒng)缺乏真核細(xì)胞所特有的翻譯后加工系統(tǒng)，無法組裝形成寡聚體的蛋白，這些嚴(yán)重制約了對MBL分子的研究。因此，本課題擬通過原核表達系統(tǒng)表達MBL的單肽鏈并在其N端加一段標(biāo)簽肽(即rhMBL△N-strep-tagII)，利用膠原蛋白的3條肽鏈自動相互纏繞成α-螺旋的性質(zhì)而裝配形成膠原樣蛋白的三級結(jié)構(gòu)即亞單位，然后籍標(biāo)簽肽與鏈親和素之間的相互作用而形成寡聚體形式的MBL分子。通過與血漿來源的天然

5、MBL比較，分析其結(jié)合配體、MASP并啟動補體凝集素途徑及結(jié)合吞噬細(xì)胞膠凝素受體的活性，評價其生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性。 一、重組人N端缺失MBL與Strep-tagII標(biāo)簽融合蛋白表達及鑒定 使用Primerpremier5.0軟件，設(shè)計并合成引物，并在上游引物酶切位點后插入Strep-tagII標(biāo)簽肽基因序列，以含有漢族人野生型MBL全長編碼區(qū)cDNA的質(zhì)粒pGEM-MBL為模板，PCR擴增出長度約640bp的人N端缺

6、失MBL-Strep-tagII融合蛋白(MBL△N-strep-tagII)基因片段，將其克隆至pET43.1a原核表達載體中，構(gòu)建的重組表達載體經(jīng)BamHI和EcoRl酶切后出現(xiàn)約7525bp和640bp的片段，經(jīng)測序鑒定序列正確后，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，以IPTG誘導(dǎo)重組pET43.1a-MBL△N-strep-tagII質(zhì)粒表達MBL△N-strep-tagII融合蛋白?？扇苄员磉_的MBL△N-strep-tagII

7、融合蛋白經(jīng)Ni+-NTAagarose層析柱純化，獲得了純化的融合蛋白。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳出現(xiàn)Mr約為97000的條帶，Westernblot分析顯示，純化的目的蛋白能與鼠抗人MBL-CRD抗體結(jié)合；ELISA表明，目的蛋白既能與糖基配體結(jié)合又能與2個MASP結(jié)合，同時也顯示與鏈親和素有良好的結(jié)合能力。 二、基于鏈親和素四聚體特性體外組裝寡聚體MBL蛋白 本室曾原核表達MBL的CRD和CLR蛋白，都因其膠原樣

8、蛋白的3條肽鏈相互纏繞成α-螺旋而自裝配成具有生物學(xué)活性的三級結(jié)構(gòu)，而rhMBL△N-strep-tagII單鏈蛋白中的包含有CLR和CRD兩部分，所以rhMBL△N-strep-tagII單鏈蛋白在緩沖液中反復(fù)透析，自動裝配成了三聚體即亞單位。還原和非還原SDS-PAGE和Westernblot結(jié)果顯示，在約Mr50000的蛋白條帶為重組MBL的亞單位。ELISA結(jié)果表明亞單位蛋白對甘露聚糖的結(jié)合能力與單鏈蛋白比較有所提高，但其對鏈親

9、和素的結(jié)合能力卻比單鏈蛋白明顯降低。因此，改善結(jié)合緩沖液后，加入鏈親和素進行組裝。SDS-PAGE結(jié)果出現(xiàn)Mr97000、Mr125000和Mr220000三處條帶，表明獲得了與鏈親和素結(jié)合的二、三、四聚體重組MBL蛋白。 三、組裝寡聚體MBL蛋白功能初步鑒定 本實驗的目的分析組裝寡聚體MBL蛋白是否具有生物學(xué)活性和免疫學(xué)功能。組裝寡聚體MBL蛋白與酵母菌細(xì)胞壁甘露聚糖結(jié)合，使之產(chǎn)生可見的凝集現(xiàn)象，但效價比天然MBL蛋白

10、和哺乳細(xì)胞表達的重組MBL蛋白低。配體結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，組裝寡聚體MBL蛋白能與配體甘露聚糖和2種MASP(即MASP1、MASP2)結(jié)合，但結(jié)合能力低于天然的MBL蛋白。補體C4d沉積試驗揭示，組裝寡聚體MBL蛋白與包被的甘露聚糖結(jié)合，啟動補體凝集素途徑，但這種活性比天然MBL蛋白低。此外，該組裝寡聚體MBL蛋白能與THP1細(xì)胞結(jié)合，提示其可結(jié)合于吞噬細(xì)胞的膠凝素受體。 本實驗基于鏈親和素四聚體的特性，通過體外組裝，制備了寡聚體重