酸酐類雙功能試劑修飾輔助的蛋白質(zhì)組研究新方法及其應用.pdf

1、本論文針對目前定量蛋白質(zhì)組研究方法不完善，定量試劑盒價格昂貴，試劑合成困難和完全依靠進口、無自主知識產(chǎn)權(quán)的研究現(xiàn)狀，發(fā)展和建立了一系列基于酸酐雙功能試劑修飾輔助的蛋白質(zhì)組學研究新方法。 論文第一部分建立了酸酐類雙功能試劑螯合稀土金屬元素標記的生物質(zhì)譜檢測定量蛋白質(zhì)組新方法。在該方法中，創(chuàng)新性地將價廉易得的雙功能試劑二乙三胺五乙酸(DTPA)雙酸酐偶合到蛋白質(zhì)肽段的伯氨基，然后利用該試劑的螯合作用分別結(jié)合化學與物理性質(zhì)極其接近的

2、稀土金屬元素，作為生物質(zhì)譜檢測中的質(zhì)量標簽，建立了蛋白質(zhì)組相對定量的新方法。該方法與目前的蛋白質(zhì)組學定量方法相比，具有普遍標記、沒有肽段歧視、試劑價格低廉容易獲得、被標記的肽段在二級質(zhì)譜裂解中能夠產(chǎn)生連續(xù)的y系列離子，可以提高鑒定的可靠性等優(yōu)點。該方法相關(guān)的研究內(nèi)容已經(jīng)發(fā)表在國際期刊Analytical Chemistry(2006，78，6614-6621)。 論文第二部分針對蛋白質(zhì)組定量結(jié)果的準確性和可靠性的問題，建立了一

3、種基于酸酐類雙功能試劑修飾輔助的，結(jié)合穩(wěn)定同位素<'18>O標記，生物質(zhì)譜檢測的雙重定量新策略。該雙重定量策略包括了兩種定量標記方法，即化學<'18>O標記方法和化學與酶切結(jié)合的<'18>O標記方法?；瘜W<'18>O標記方法與傳統(tǒng)的<'18>O標記方法相比，不存在<'18>O到<'16>O原子的回交現(xiàn)象；化學與酶切結(jié)合的標記方法避免了同位素峰的重疊現(xiàn)象，兩種標記方法獲得的定量結(jié)果可以相互驗證，提高了結(jié)果的準確性，并且兩種標記方法中只需要

4、一次的樣品制備，既節(jié)省了樣品制備過程中的人力物力，又減小了樣品制備過程中帶來的誤差。 論文的第三部分利用釀酒酵母為研究對象，將本論文第二部分建立的<'18>O雙重定量策略應用于實際的生物樣本分析，對方法在實際樣本應用中的可行性進行了全面的考查，對該定量策略的定量準確性和可靠性做了進一步的評價，并研究了酵母在敲除與不敲除YHB1基因的差異蛋白質(zhì)組中差異表達的蛋白質(zhì)，對差異蛋白質(zhì)的功能進行了初步的探討。 論文的第四部分針

5、對敲除YHB1基因的釀酒酵母在NO刺激與不刺激兩種培養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)表達的變化，用<'18>O雙重定量策略尋找表達量發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白質(zhì)，并且對其生物功能和相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路進行了初步的討論，加深了對NO相關(guān)的信號傳遞途徑和生物學調(diào)控機制的認識。 本論文的最后一部分針對目前蛋白質(zhì)組研究面臨的生物樣本肽段混合物高度復雜、蛋白質(zhì)末端信息難以獲得和質(zhì)譜鑒定可信度低等問題，通過化學修飾輔助的酸酐類雙功能試劑標記蛋白質(zhì)的N端，離子交