Let-7f在膠質(zhì)瘤中的表達與臨床的相關性及調(diào)控靶基因RAB40C對細胞增殖的影響.pdf

1、本課題實驗分為以下兩部分:
　　第一部分:Let-7f在膠質(zhì)瘤中的表達及其與臨床的相關性研究
　　目的:
　　檢測Let-7f在膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及血清中的表達水平;探討Let-7f表達水平與患者臨床特征之間的關系及對預后判斷及早期診斷的意義。
　　方法:
　　1、通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測108例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及瘤旁非瘤性正常腦組織樣本中Let-7f的表達情況;檢測108例膠質(zhì)瘤

2、患者及40例健康對照者血清中Let-7f的表達情況。
　　2、分析膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中Let-7f表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理級別及術前KPS評分等臨床特點的相關性。
　　3、以Kaplan-Meier生存分析方法研究獲得完整隨訪資料的101例膠質(zhì)瘤患者中腫瘤組織Let-7f表達水平與患者術后生存時間的相關性。
　　4、以單因素及多因素Cox比例風險回歸模型分析膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小、部位、

3、病理級別、KPS評分、Let-7f表達水平，尋找影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素。
　　5、分析不同級別和組別的膠質(zhì)瘤患者血清Let-7f表達水平的差異。通過ROC曲線及ROC曲線下面積(AUC)來評估血清Let-7f表達水平對不同病理級別膠質(zhì)瘤的早期診斷價值。
　　結(jié)果:
　　1、Let-7f在膠質(zhì)瘤組織及血液中均呈低表達。
　　108例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織樣本中Let-7f的表達水平明顯低于正常腦組織（0.45

4、±0.203VS1.09±0.211），兩者間有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.000);膠質(zhì)瘤患者血清中Let-7f表達水平較40例健康對照者血清有明顯降低（0.39±0.201VS0.88±0.260 P＜0.001）。Let-7f在膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及其對應的血清樣本中的表達水平具有相關性，相關系數(shù)R2=0.853(P=0.01)。
　　2、膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達與腫瘤大小、WHO分級顯著相關。
　　膠質(zhì)瘤組織中Let

5、-7f的表達水平在不同腫瘤大小和不同病理級別患者中有顯著差異，而與其它因素無明顯相關性。以Let-7f的平均表達水平(0.51)為界，所有患者分為高、低水平表達兩組。70.6％的WHO分級Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者進入低水平表達組;而Ⅰ～Ⅱ級患者中，Let-7f的表達水平低于均值的僅有35.1％，差異顯著（x2=13.588 P=0.001）。不同WHO分級的兩組患者Let-7f平均表達水平者有顯著差異(0.33±0.191 VS0.79±0.

6、20 P＜0.001)。腫瘤直徑在3cm以上的膠質(zhì)瘤患者Let-7f低表達比例及Let-7f平均表達水平與腫瘤直徑在3cm以下患者有顯著差異(x2=8.306 P=0.004;0.38±0.193VS0.69±0.198 P＜0.01)。
　　3、膠質(zhì)瘤組織中Let-7f的表達水平越低，患者術后生存時間越短。
　　Kaplan-Meier生存分析方法顯示:獲得完整隨訪資料的101例膠質(zhì)瘤患者中腫瘤組織Let-7f呈低表達水平

7、的患者術后生存時間明顯短于高表達組患者(24.1month VS34.5 month)，Log rank檢驗顯示兩組有顯著性差異(P=0.000)。47例WHO分級Ⅲ～Ⅳ級患者中，Let-7f低表達組的患者術后中位生存時間與高表達組患者差異顯著（13.2month VS24.5 month P＜0.001）。而在54例Ⅰ～Ⅱ級患者中，Let-7f低表達組患者的術后中位生存時間與高表達組患者并無顯著性差異(37.3month VS41.7

8、 monthP＞0.05)。
　　4、Let-7f是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素。
　　單因素分析檢驗結(jié)果顯示，KPS評分＜80分、WHO分級增高和腫瘤組織中Let-7f低表達均是影響膠質(zhì)瘤患者預后的因素。運用單變量和多變量Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果顯示，KPS評分、WHO分級和腫瘤組織中Let-7f表達水平均是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立因素指標。KPS評分越低、WHO分級越高和以及腫瘤組織中Let-7f表達水平越低，

9、則患者的預后越差。顯示Let-7f的表達與預后顯著相關，是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素(HR=1.971，95％CI=1.381-2.813，P=0.000)。
　　5、膠質(zhì)瘤患者血清Let-7f表達水平對惡性膠質(zhì)瘤早期診斷具有一定意義。
　　膠質(zhì)瘤患者的血清Let-7f表達水平與WHO分級密切相關（P＜0.001）。所有級別膠質(zhì)瘤的AUC為0.719(95％ CI，0.653-0.828)。血清Let-7f的臨界值為1

10、.50，相應的敏感度和特異度分別為53.6％和82.1％。高級別膠質(zhì)瘤AUC為0.795(95％ CI，0.688-0.901)，提示Let-7f對惡性膠質(zhì)瘤早期診斷具有一定意義。
　　結(jié)論:
　　膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及血液中Let-7f均呈現(xiàn)低表達。Let-7f可作為一種新的腫瘤標志物，對判定膠質(zhì)瘤惡性程度和預后分析帶來幫助，并對惡性膠質(zhì)瘤具有一定的早期診斷價值。
　　第二部分:Let-7f通過靶基因RAB40C抑制膠

11、質(zhì)瘤細胞增殖的機制研究
　　目的:
　　檢測Let-7f在人膠質(zhì)瘤細胞系和正常星形細胞中的表達情況;尋找并驗證Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞中的下游靶基因，探討Let-7f通過靶基因調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖的作用機制。
　　方法:
　　1、應用RT-qPCR方法檢測Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G和正常星型細胞中的的表達水平。
　　2、通過Lipofectamine2000瞬時

12、轉(zhuǎn)染技術將Let-7fmimics、Let-7finhibitor分別轉(zhuǎn)染入A172、T98G。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。CCK-8法進行細胞增殖實驗，以細胞轉(zhuǎn)染作為時間節(jié)點，檢測時間分別為細胞生長的第24、48、72、96小時。流式細胞儀檢測細胞生長周期變化。
　　3、檢索miRBase、Targetscan、microRNAs等數(shù)據(jù)庫，尋找Let-7f的目標靶基因。運用RT-PCR和Western blot技術分別對轉(zhuǎn)染細胞

13、進行檢測，研究抑制和過表達Let-7f對靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的影響。應用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證尋找到的靶基因是否為Let-7f的下游目標靶基因。
　　4、分別干擾和過表達Let-7f及靶基因RAB40C，并分為4組進行比較:A組:control、siRNA-Let-7f、si-RAB40C、siRNA-Let-7f+si-RAB40C;B組:control、Let-7fmimics、pEGFP-C1-RAB40C、Let-7fmi

14、mics+pEGFP-C1-RAB40C;C組:control、siRNA-Let-7f、pEGFP-C1-RAB40C、siRNA-Let-7f+ pEGFP-C1-RAB40C;D組:control、Let-7fmimics、si-RAB40C、Let-7fmimics+si-RAB40C。采用CCK-8法對轉(zhuǎn)染細胞進行增殖能力檢測，通過比較分析Let-7f及其靶基因RAB40C在膠質(zhì)瘤細胞增殖活動中的分子作用機制。
　　結(jié)果

15、:
　　1、Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系中表達下調(diào)
　　Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G中的表達水平明顯低于正常星型細胞中的的表達(P＜0.01），選擇表達最低的A172、T98G進行進一步的實驗研究。
　　2、Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖
　　Lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染法成功將Let-7fmimics、Let-7finhibitor轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細胞A

16、172、T98G，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率滿意。轉(zhuǎn)染Let-7fmimics后細胞增殖能力比轉(zhuǎn)染Let-7fmimicsNC或未轉(zhuǎn)染組明顯降低，流式細胞儀檢測顯示G0期細胞比例增加，S期細胞比例減少;而轉(zhuǎn)染Let-7finhibitor后細胞的增殖能力顯著升高，流式細胞儀檢測顯示G0期細胞比例降低，S期細胞比例升高。差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3、Let-7f功能靶基因為RAB40C
　　搜索數(shù)據(jù)庫結(jié)果發(fā)現(xiàn)R

17、AB40C的3'UTR與Let-7f存在潛在的結(jié)合位點。膠質(zhì)瘤細胞系轉(zhuǎn)染Let-7fmimics、Let-7finhibitor結(jié)果顯示:相比于未轉(zhuǎn)染組、Let-7fmimicsNC組，Let-7fmimics組的RAB40C表達水平降幅明顯(P＜0.001)。雙熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染野生型RAB40C表達載體與Let-7fmimics后，熒光素酶相對活性明顯下降(P＜0.01）;而共轉(zhuǎn)染野生型RAB40C表達載體與L