抑制自噬對三陰性乳腺癌EGFR靶向治療的影響研究.pdf

1、目的：乳腺癌處于女性惡性腫瘤的首要位置。三陰性乳腺癌(triple negative breastcancer，TNBC)屬于乳腺癌luminal分型中的一種特殊的分子亞型，其特點為雌激素受體、孕激素受體及表皮生長因子受體2均陰性表達。TNBC侵襲性高，具有首發(fā)年齡小、病情進一步發(fā)展時間快、影像學(xué)表現(xiàn)各不相同、非常容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點。據(jù)相關(guān)的研究表明在中國女性中，TNBC的發(fā)病率大約占到了乳腺癌發(fā)病率的17％。由于相關(guān)受體均陰性表達，T

2、NBC沒有內(nèi)分泌和HER-2靶向治療的機會，目前化療是TNBC主要的治療方法。TNBC惡性程度很高、病人預(yù)后很差，這些特點與表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）在TNBC患者中高度表達密切相關(guān)。但是最近發(fā)現(xiàn)EGFR靶向治療的相關(guān)研究并沒有取得理想的療效，療效不理想的原因主要和EGFR分子靶向治療過程中耐藥性的產(chǎn)生相關(guān)。如何增強TNBC靶向治療敏感性成為目前研究的新熱點。
　

3、　方法：通過吉非替尼單獨用藥或者聯(lián)合兩種作用機制不同的自噬抑制劑3甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3MA）和巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1，BAF)處理TNBC細胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231細胞，采用MTT實驗方法、克隆形成實驗方法檢測腫瘤細胞的增殖抑制率與克隆形成率，通過應(yīng)用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的周期分布、Western blot免疫印跡法檢測與DNA損傷相關(guān)的標(biāo)志性蛋白和線粒體凋亡相關(guān)標(biāo)

4、志性蛋白的表達，進一步驗證在TNBC細胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231中，自噬抑制劑對EGFR抑制劑吉非替尼治療敏感性的具體機制。通過ROS染色測定實驗明確自噬抑制劑與吉非替尼聯(lián)合用藥時導(dǎo)致的凋亡與線粒體凋亡的關(guān)系。建立BALB/c裸鼠移植瘤模型，通過裸鼠體內(nèi)實驗驗證自噬抑制劑對吉非替尼治療敏感性的影響，免疫組化方法檢測移植瘤中Cleaved-CASP3的表達。
　　結(jié)果：吉非替尼+3MA組和吉非替尼+BAF組MDA

5、-MB-468細胞的IC50分別為（4.1±0.2）μmol/L和（3.8±0.3）μmol/L，均明顯低于吉非替尼組[（7.0±0.2）μmol/L，均P＜0.05]。吉非替尼+3MA組和吉非替尼+BAF組MDA-MB-231細胞的IC50分別為（9.7±0.1）μmol/L和（7.7±0.2）μmol/L，均明顯低于吉非替尼組[（14.7±0.1）μmol/L，均P＜0.05]。克隆形成實驗顯示，吉非替尼與自噬抑制劑聯(lián)合用藥組MDA

6、-MB-468細胞克隆形成率分別為（29.85±5.54）％和（33.58±6.31）％，顯著低于單用吉非替尼組（63.46±8.32）％(Z=-2.309，P＜0.017)。吉非替尼與自噬抑制劑聯(lián)合用藥組MDA-MB-231細胞克隆形成率分別為（22.63±6.27）％和（31.54±5.81）％，顯著低于單用吉非替尼組（49.35±6.56）％(Z=-2.309，P＜0.017)。吉非替尼聯(lián)兩種作用機制不同的自噬抑制劑3MA和BAF

7、，誘導(dǎo)了TNBC細胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231細胞DNA發(fā)生損傷，誘導(dǎo)了TNBC細胞發(fā)生G0/G1期細胞周期阻滯。吉非替尼聯(lián)合3MA和BAF處理TNBC細胞，導(dǎo)致細胞氧自由基ROS的表達水平明顯增加。Western Blot免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡相關(guān)蛋白細胞色素C、BAX、cleaved CASP3表達水平明顯增加。裸鼠移植瘤模型實驗發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑聯(lián)合吉非替尼處理后， MDA-MB-468細胞腫瘤的生長受到明顯的抑