擬南芥AtFes1A與植物耐熱性.pdf

1、熱激蛋白HSP70通過(guò)ATPase循環(huán)完成其功能。多種蛋白及輔助分子伴侶參與HSP70的ATPase循環(huán)，如J蛋白和底物能夠刺激HSP70水解ATP生成ADP，而ADP脫離HSP70則需要核苷酸交換因子(Nucleotide Exchange Factors，NEFs)的協(xié)助，因此，NEFs是HSP70分子伴侶體系中的一類關(guān)鍵輔助因子。目前，NEFs的研究多集中于原核生物(大腸桿菌中的GrpE)、酵母(Fes1p、Sse1p)和哺乳動(dòng)物

2、(Bag-1、HspBP1)中，有關(guān)植物NEFs的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，作者對(duì)酵母Fes1基因在擬南芥中的同源物進(jìn)行了研究。
　　擬南芥基因組中存在三個(gè)Fes1基因的同源物，它們都?xì)w屬于ARM(Armadillo repeat)蛋白家族。作者將它們命名為AtFes1A(At3g09350)、AtFes1B(At3g53800)、AtFes1C(At5g02150)。Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在這三個(gè)成員中，AtFes1A

3、是高溫誘導(dǎo)下表達(dá)量最高的一個(gè)，所以作者主要研究了AtFes1A基因。對(duì)AtFes1A的定位和表達(dá)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AtFes1A是一個(gè)定位在細(xì)胞質(zhì)中的，受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。作者自ABRC訂購(gòu)了AtFes1A基因的T-DNA插入突變體(salk-021784和salk-012416)，對(duì)AtFes1A基因的功能進(jìn)行研究。最后，作者以熱敏感的北美螢火蟲(chóng)螢光酶作為靶標(biāo)蛋白，研究了AtFes1A基因缺失導(dǎo)致擬南芥熱敏感的原初起因。
　　

4、主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.擬南芥基因組中存在三個(gè)Fes1的同源基因:AtFes1A、AtFes1B和AtFes1C。AtFes1A是三個(gè)成員中高溫誘導(dǎo)表達(dá)最高的一個(gè)基因。在Fes1基因缺失酵母中導(dǎo)入高拷貝質(zhì)粒pYX242攜帶的AtFes1A基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)酵母的熱敏感表型基本得到恢復(fù)，說(shuō)明在耐熱方面，AtFes1A具有與酵母Fes1相似的功能。
　　為確定AtFes1A基因的表達(dá)特性，作者檢測(cè)了該基因在高溫、低溫、

5、干旱、NaCl脅迫下的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AtFes1A基因的表達(dá)受高溫誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)，在低溫和干旱脅迫下表達(dá)稍有上調(diào)，NaCl不能誘導(dǎo)AtFes1A基因的表達(dá)。利用農(nóng)桿菌侵染的方法，將含有AtFes1A基因的cDNA序列和GFP基因的融合基因轉(zhuǎn)化擬南芥，GFP熒光分析發(fā)現(xiàn):GFP在保衛(wèi)細(xì)胞和原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，說(shuō)明AtFes1A基因定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　為檢測(cè)AtFes1A蛋白能否加速ADP脫離從而提高HSP70蛋白的AT

6、Pase活性，作者利用孔雀綠-鉬酸銨分光光度法進(jìn)行了穩(wěn)態(tài)的ATPase實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè) HSP70水解ATP產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷的速度來(lái)判斷AtFes1A是否對(duì)HSP70具有刺激作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度或低濃度的AtFes1A對(duì)HSP70的ATPase活性都沒(méi)有明顯的影響，說(shuō)明AtFes1A可能不具有刺激ADP加速脫離HSP70的功能。
　　2.自 ABRC訂購(gòu)了AtFes1A基因的T-DNA插入突變體(salk-021784和salk-0

7、12416)。通過(guò)PCR及測(cè)序?qū)-DNA插入 AtFes1A基因的位置進(jìn)行鑒定。salk-021784和salk-012416突變體中T-DNA分別插入AtFes1A基因的第六外顯子和第五內(nèi)含子上，突變體的純合子中檢測(cè)不到AtFes1A基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白。獲得耐熱性實(shí)驗(yàn)表明，與野生型相比，突變體在下胚軸延伸時(shí)期和幼苗時(shí)期都有明顯的獲得耐熱性缺陷，突變體種子萌發(fā)時(shí)期的耐熱性也明顯降低。突變體 salk-021784的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，At

8、Fes1A基因的表達(dá)能夠基本修復(fù)突變體的熱敏感表型。以上結(jié)果充分說(shuō)明，突變體的熱敏感表型確實(shí)是由于AtFes1A基因敲除引起的。
　　3.為研究AtFes1A基因突變導(dǎo)致擬南芥熱敏感的原因，作者檢測(cè)高溫處理后，與耐熱相關(guān)的HSPs(HSP70、HSP101、sHSP classI和sHSP classII)基因和Hsfs(HsfA2和HsfB1)基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況。Northern雜交結(jié)果顯示，與野生型相比，突變體salk-02

9、1784中HSPs和Hsfs基因的轉(zhuǎn)錄本水平較高。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，作者利用Real-Time PCR對(duì)突變體(salk-021784和salk-012416)中耐熱相關(guān)的HSPs和Hsfs基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了檢測(cè)，所得結(jié)果Northern雜交的結(jié)果一致。以上結(jié)果充分說(shuō)明，AtFes1A基因缺失導(dǎo)致耐熱相關(guān)的熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本升高。因此，AtFes1A是熱激蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子。
　　HSP70的高表達(dá)能夠抑制其他熱激蛋

10、白的表達(dá)。在salk-021784中，HSP70以及其他的一些熱激基因的轉(zhuǎn)錄本都上調(diào)，HSP70的高表達(dá)并沒(méi)有起到抑制作用。因此，作者檢測(cè)了salk-021784突變體中HSP70蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體中的HSP70的蛋白含量并沒(méi)有因?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄本的升高而升高，而是明顯低于野生型中的。本研究首次報(bào)導(dǎo)了AtFes1A能夠影響HSP70的穩(wěn)定性。
　　4.作者利用western-blotting雜交檢測(cè)了熱激后，s

11、alk-021784和野生型擬南芥中全蛋白的泛素化程度。Western-blotting雜交結(jié)果表明，與野生型相比，salk-021784突變體中有更多的變性蛋白底物被標(biāo)記了泛素分子，突變體中有更多的變性蛋白被蛋白酶降解。
　　為更進(jìn)一步的研究擬南芥熱敏感的原因，作者構(gòu)建了番茄線粒體小分子熱激蛋白 LeHSP23.8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光酶基因的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化salk-021784和野生型擬南芥。轉(zhuǎn)螢光酶基因擬南芥在

12、38℃適應(yīng)2h以激活螢光酶的表達(dá)(熱激啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))，隨后45℃高溫處理2h滅活螢光酶，放置在培養(yǎng)箱中恢復(fù)，檢測(cè)恢復(fù)不同時(shí)間的螢光酶的活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型中的螢光酶相比，突變體中的螢光酶的復(fù)性程度明顯較低。此外，作者還利用western-blotting檢測(cè)了恢復(fù)不同時(shí)間的可溶性的螢光酶的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在突變體中的可溶性螢光酶的含量較低，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示螢光酶的活性較低是由于螢光酶可溶性蛋白含量少造成的。利用麥胚系統(tǒng)(用抗At

13、Fes1A抗體封閉麥胚中的AtFes1A蛋白或在麥胚中添加AtFes1A蛋白)檢測(cè)變性螢光酶的復(fù)性情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AtFes1A的存在對(duì)螢光酶的復(fù)性沒(méi)有顯著的影響，說(shuō)明，在體外的實(shí)驗(yàn)中，AtFes1A不能影響分子伴侶機(jī)器的功能。
　　總之，AtFes1A是新發(fā)現(xiàn)的，影響細(xì)胞質(zhì)HSP70穩(wěn)定性和影響變性底物復(fù)性的，植物耐熱相關(guān)基因。
　　本文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　在國(guó)際上首次報(bào)道了擬南芥 AtFes1A基因是植物耐熱性相