基于冬蟲(chóng)夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)IP4的ELISA定量評(píng)價(jià)新方法研究.pdf

1、冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科冬蟲(chóng)夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上形成的幼蟲(chóng)尸體及子座的干燥復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效。冬蟲(chóng)夏草菌寄主昆蟲(chóng)為蝙蝠蛾科多屬動(dòng)物的幼蟲(chóng)，主要分布于四川、西藏、青海、甘肅、云南，海拔2800 m以上的青藏高原高山草甸地區(qū)，分布環(huán)境生態(tài)脆弱，近年來(lái)由于全球變暖，雪線上移，分布區(qū)域日趨減少。同時(shí)由于冬蟲(chóng)夏草特殊的藥理作用，其在藥用

2、、保健等用量日益增加，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量高，價(jià)格連年翻升，供需嚴(yán)重不足，且目前無(wú)成熟的人工繁殖技術(shù)，造成市場(chǎng)上冬蟲(chóng)夏草摻假、摻偽現(xiàn)象嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道冬蟲(chóng)夏草偽品引起頭暈、惡心等副作用，嚴(yán)重影響了冬蟲(chóng)夏草的用藥安全。部分偽品其外觀、粉末特征與正品極其相似，藥典現(xiàn)有指標(biāo)性成分腺苷非正品所特有，難以形成規(guī)范可操作的新標(biāo)準(zhǔn)。冬蟲(chóng)夏草的鑒定研究成為研究熱點(diǎn)，亟需新的鑒定方法。
　　作為初級(jí)代謝產(chǎn)物的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的種屬特異性，且在生物體內(nèi)以及不同

3、部位間都具有穩(wěn)定的含量。課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)正品冬蟲(chóng)夏草具有特異的蛋白質(zhì)，可作為鑒定的指標(biāo)性組分，并利用雙向電泳技術(shù)（2-DE）分離冬蟲(chóng)夏草蛋白，獲得冬蟲(chóng)夏草與偽品電泳圖譜，篩選得26個(gè)指標(biāo)性蛋白斑點(diǎn)作為冬蟲(chóng)夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)，可定性鑒別冬蟲(chóng)夏草。本研究主要在前期研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展了以下工作：
　　1．雙向電泳方法驗(yàn)證冬蟲(chóng)夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)組分
　　前期課題組采用雙向電泳技術(shù)（2-DE）對(duì)冬蟲(chóng)夏草及偽品進(jìn)行分析，篩選出冬蟲(chóng)夏草及

4、偽品指標(biāo)性蛋白質(zhì)26個(gè)。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，繼續(xù)優(yōu)化2-DE條件，建立冬蟲(chóng)夏草蛋白質(zhì)2-DE標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并通過(guò)PDQUEST軟件比對(duì)不同產(chǎn)地蛋白質(zhì)2-DE共有蛋白圖譜與偽品2-DE圖譜，從26個(gè)指標(biāo)性蛋白斑點(diǎn)中驗(yàn)證得到（核實(shí)）21個(gè)指標(biāo)性蛋白質(zhì)。
　　2．冬蟲(chóng)夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)的鑒定分析
　　21個(gè)指標(biāo)性蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析后歸納其生物功能。結(jié)果表明21個(gè)指標(biāo)性蛋白質(zhì)中參與DNA損傷修復(fù)占4％，參與mRNA翻譯、轉(zhuǎn)錄過(guò)

5、程蛋白質(zhì)占9%，參與免疫應(yīng)答過(guò)程蛋白質(zhì)占4%，參與細(xì)胞分裂增殖過(guò)程的蛋白質(zhì)占4%；參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等，具有載體功能蛋白質(zhì)占13%，參與蛋白質(zhì)折疊、再折疊過(guò)程蛋白質(zhì)比例為8%，輔助恢復(fù)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)恢復(fù)活性；與膜內(nèi)蛋白、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)占大多數(shù)，比例為38%，參與胞吞作用，細(xì)胞骨架重排，膜蛋白質(zhì)運(yùn)輸和再循環(huán)，與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性有關(guān)。對(duì)指標(biāo)性蛋白的功能分析為后期實(shí)驗(yàn)篩選具生物活性指標(biāo)性蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　其中IP4（指標(biāo)性蛋白質(zhì)4

6、）屬氰酸合酶，是催化其氰酸鹽水解的酶，冬蟲(chóng)夏草菌可通過(guò)氰酸合酶水解克服環(huán)境氰酸鹽的毒性或分解氰酸，作為氮的來(lái)源。結(jié)合前期2-DE實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IP4豐度高，分離度及穩(wěn)定性較好，因此確定其為后續(xù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)性蛋白。
　　3.冬蟲(chóng)夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)IP4的制備與鑒定
　　在獲得IP4基本信息的基礎(chǔ)上，建立并優(yōu)化PAGE、HPLC等尋找冬蟲(chóng)夏草指標(biāo)性蛋白方法，確定堿性梯度PAGE為最佳指標(biāo)性蛋白IP4分離與制備方法，此時(shí)分離實(shí)驗(yàn)條件為T(mén)=5

7、%~15%，恒壓140 v。進(jìn)行堿性梯度PAGE割膠制備，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為冬蟲(chóng)夏草及偽品21個(gè)指標(biāo)性蛋白中的IP4，電透析法回收蛋白 IP4，回收率2.51%~3.27%；采用HPLC結(jié)合PAGE、IEF等方法鑒定其純度，達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　4．IP4多克隆抗體的制備與ELISA定量分析方法建立
　　將純化后蛋白IP4作為抗原免疫小鼠，得到多克隆抗體，測(cè)定其效價(jià)與特異性。進(jìn)一步考察了IP4抗體ELISA檢測(cè)方法的最適條件：包

8、被液的選擇、抗原包被時(shí)間、封閉液的選擇與封閉時(shí)間、HRP酶標(biāo)二抗的工作濃度、底物顯色時(shí)間等，建立ELISA測(cè)定冬蟲(chóng)夏草多克隆抗體特異性方法。得到最佳包被液為 NBS，包被條件為37℃過(guò)夜，封閉液為1%PBSB，封閉時(shí)間為2 h，HRP酶標(biāo)二抗工作濃度為1：3000，底物顯色時(shí)間為20 min。
　　對(duì) ELISA定量分析方法進(jìn)行特異性檢測(cè)，正品冬蟲(chóng)夏草為陽(yáng)性反應(yīng)，偽品冬蟲(chóng)夏草為陰性反應(yīng)，表明該方法可定性鑒別冬蟲(chóng)夏草；同時(shí)建立ELI

9、SA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時(shí)冬蟲(chóng)夏草（四川雅家梗）蛋白中IP4含量為0.492 mg/mL占干藥材質(zhì)量的0.075%，占可溶性蛋白比例為3.71%，冬蟲(chóng)夏草（西藏林芝）蛋白IP4含量為0.396 mg/mL，占干藥材質(zhì)量的0.063%，占可溶性蛋白3.22%，冬蟲(chóng)夏草（青海西寧）蛋白IP4含量為0.421 mg/mL，占干藥材質(zhì)量的0.052%，占可溶性蛋白3.37%。不同產(chǎn)地間IP4含量有所不同，占干藥材質(zhì)量均大于0.05%，提示IP4可作