食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的初步研究.pdf

1、艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是人類重大疾病，雖然國內(nèi)外已開展了大量的探索性研究，至今未見有效的防治手段，其主要原因之一是缺少能夠感染HIV（Human immunodeficiency virus）致病的動物疾病模型。目前諸多研究發(fā)現(xiàn)TRIM5alpha（Tripartite motif protein5 alpha）是抑制HIV感染的限制因子，能抑制多種逆轉(zhuǎn)錄病毒，它是重要

2、的抗病毒因子。
　　TRIM5α包含了RING結(jié)構(gòu)域、B-Box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域和SPRY（B32.0）結(jié)構(gòu)域。HIV包膜和宿主細(xì)胞膜融合之后，衣殼和TRIM5α蛋白多聚體特異性的結(jié)合，TRIM5α發(fā)揮泛素連接酶的活性，干擾了病毒脫衣殼的有序過程，從而達(dá)到抑制病毒的目的。TRIM5α在細(xì)胞內(nèi)主要以三聚體的形式存在，胞質(zhì)內(nèi)的TRIM5α蛋白具有實(shí)質(zhì)抑制HIV-1的能力。食蟹猴TRIM5α比人類TRIM5α有更強(qiáng)的

3、抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄的效力。本研究試圖通過敲低食蟹猴 TRIM5α基因，建立有可能感染 HIV的動物模型及探究TRIM5α的重要功能。
　　基于此，本研究針對食蟹猴TRIM5α基因，利用RNAi（Ribose nucleic acid interfere）技術(shù)合成了相應(yīng)的shRNA（Short hairpin RNA），構(gòu)建了含有相應(yīng)shRNA序列的3個(gè)shRNA質(zhì)粒，分別命名為shRNA1質(zhì)粒、shRNA2質(zhì)粒和shRNA3質(zhì)粒

4、。將表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制作出相應(yīng)的慢病毒載體。將得到的慢病毒分別感染食蟹猴胚胎成纖維細(xì)胞（Cynomolgus monkeyembryo fibroblast,CMEF），被感染的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)的CMEF細(xì)胞系，分別命名為 NTC（Negative Temperature Coefficient）-CMEF、shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF細(xì)胞。通過qRT-P

5、CR分別檢測TRIM5α基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTC-CMEF細(xì)胞內(nèi)TRIM5α基因水平是野生型CMEF表達(dá)水平的97％，shRNA1-CMEF、shRNA2和shRNA3細(xì)胞內(nèi)的TRIM5α基因水平分別是野生型CMEF的52%，43%和39%。通過Western blot檢測TRIM5α的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTC-CMEF細(xì)胞內(nèi)TRIM5α蛋白表達(dá)水平是野生型 CMEF表達(dá)水平的108%，shRNA1-CMEF、shRNA2-C

6、MEF和shRNA3-CMEF細(xì)胞內(nèi)的TRIM5α蛋白基因水平分別是野生型CMEF的59%，47%和49%。在驗(yàn)證TRIM5α敲低對HIV病毒感染方面，利用表達(dá)RFP的假HIV病毒，分別對NTC-CMEF、shRNA1-CMEF、shRNA2-CMEF和shRNA3-CMEF細(xì)胞進(jìn)行再次感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明TRIM5α基因敲低后的食蟹猴細(xì)胞系相對野生型細(xì)胞可以抑制假 HIV-1病毒的感染能力。在食蟹猴胚胎上初步驗(yàn)證了shRNA3慢病毒載體