自身免疫性肝炎患者腸屏障功能及肝臟巨噬細(xì)胞極化分型的研究.pdf

1、目的：
　　本研究首先比較自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）患者、AIH肝硬化患者及健康對照者口服乳果糖（lactulose，L）和甘露醇（mannitol，M）雙糖分子探針后尿液中二者的回收情況以評價(jià)各組腸屏障功能，旨在探索腸屏障功能改變、腸道來源的抗原如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在AIH發(fā)生發(fā)展中的作用。另外，我們分析了 AIH患者肝組織巨噬細(xì)胞極化分型分子的表達(dá)，旨

2、在初步探討并揭示AIH患者肝組織中巨噬細(xì)胞的功能表型。
　　方法：
　　第一部分：AIH患者腸屏障功能評價(jià)
　　收集2015年1月-2016年1月于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科就診的AIH患者5例和對照AIH肝硬化患者5例、健康對照者10例。收集各組受試者口服測試液之后6小時(shí)以內(nèi)的所有尿液，利用高效液相色譜法（ high performance liquid chromatography，HPLC）測定尿液中乳果糖和甘露醇

3、的回收情況，計(jì)算尿液乳果糖/甘露醇比值也即L/M值以評價(jià)腸屏障功能。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核準(zhǔn)許（IRB2015-YX-002），所有患者均知情同意。
　　第二部分：AIH患者肝臟巨噬細(xì)胞極化分型評價(jià)
　　收集2015年1月-2016年1月于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科就診的AIH患者5例和對照肝病患者6例、肝囊腫患者5例，行超聲引導(dǎo)下肝穿刺活檢術(shù)取得長約1.5cm的肝組織條。應(yīng)用免疫組化法、免疫熒光染色法檢測各組肝病患者肝組

4、織中巨噬細(xì)胞的活化和極化分型情況。進(jìn)一步通過RT-PCR法檢測并驗(yàn)證肝組織中巨噬細(xì)胞的極化分型相關(guān)表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核準(zhǔn)許（IRB2015-YX-002），所有患者均知情同意。
　　結(jié)果：
　　第一部分：AIH患者腸屏障功能評價(jià)
　?。?）參與尿樣收集的5名AIH患者、5名AIH肝硬化患者在口服測試液后耐受良好、過程順利，無一人出現(xiàn)不良反應(yīng)。10名健康對照者中1名（10％）出現(xiàn)輕微腹脹等不良

5、反應(yīng)，2名（20%）出現(xiàn)明顯腹脹等中度不良反應(yīng)，7名（70%）出現(xiàn)腹痛腹瀉等重度不良反應(yīng)，收集結(jié)束時(shí)3名（30%）健康志愿者未收集到尿液。（2）甘露醇回歸方程：y=1.096x+6.510，乳果糖回歸方程：y=1.032x+6.362，其中，x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度的常用對數(shù)，y為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的常用對數(shù)。（3）健康對照組尿樣中可檢測到甘露醇，其回收量、回收率分別為92.35mg(14.60～209.4mg)，1.85%(0.29～4.19%)，未

6、檢測到乳果糖，L/M值為0.00（0.00～0.00）；AIH患者尿樣中乳果糖回收量、乳果糖回收率、L/M值與健康對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其甘露醇回收量362.22mg(176.67～515.36 mg)、甘露醇回收率7.24%(3.53～10.31%)與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P=0.023、0.023）；AIH肝硬化患者尿樣中甘露醇回收量414.54mg(276.53～931.18mg)、回收率8.29%(5.5

7、3～18.62%)、乳果糖回收量33.40 mg(6.80～48.31mg)、回收率0.37%(0.09～0.64%)及 L/M值0.05(0.02～0.10)與健康對照組[92.35 mg(14.60～209.4mg)、1.85%(0.29～4.19%)、0.00mg(0.00～0.00mg）、0.00%(0.00～0.00%)、0.00(0.00～0.00）]相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021、0.021、0.014、0.01

8、4、0.014）；AIH肝硬化患者尿樣中乳果糖回收量33.40 mg(6.80～48.31mg)、回收率0.37%(0.09～0.64%)、L/M值0.05(0.02～0.10)與 AIH患者[0.00mg(0.00～6.33mg）、0.00%(0.00～0.06%)、0.00(0.00～0.03）]相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004、0.004、0.007）。
　　第二部分：AIH患者肝臟巨噬細(xì)胞極化分型評價(jià)
　　（

9、1）AIH患者肝組織巨噬細(xì)胞數(shù)量增多：AIH患者與脂肪肝患者、乙肝患者相比，CD68陽性細(xì)胞絕對數(shù)均顯著增多（P=0.034、0.034），脂肪肝患者與乙肝患者相比CD68陽性細(xì)胞絕對數(shù)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）AIH患者肝組織M2型巨噬細(xì)胞相對低表達(dá)：脂肪肝患者與 AIH患者、乙肝患者相比，CD206陽性細(xì)胞絕對數(shù)顯著增多（P=0.019、0.046），AIH患者與乙肝患者相比CD206陽性細(xì)胞絕對數(shù)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；脂肪肝患者

10、肝組織CD206相對表達(dá)量顯著高于AIH患者和乙肝患者[（8.08±1.63）比（1.03±0.12）、（2.36±1.32）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），而AIH患者和乙肝患者肝組織CD206相對表達(dá)量差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AIH患者肝組織IL-10相對表達(dá)量顯著高于乙肝患者[（2.16±0.89）比（0.93±0.59）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而AIH患者與脂肪肝患者相比、乙肝患者與脂肪肝患者相比，肝組織IL

11、-10的相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）AIH患者肝組織M1型巨噬細(xì)胞相對高表達(dá)：AIH患者、乙肝患者肝組織中存在CD68與iNOS共表達(dá)的M1型巨噬細(xì)胞，脂肪肝患者和肝囊腫患者肝組織中鮮見CD68與iNOS共表達(dá)的M1型巨噬細(xì)胞；AIH患者和乙肝患者肝組織TNF-α相對表達(dá)量均顯著高于脂肪肝患者[（13.29±7.55）、（12.39±3.79）比（0.77±0.38）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），而AIH患者和乙肝患者

12、TNF-α相對表達(dá)量的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AIH患者和乙肝患者肝組織iNOS相對表達(dá)量均顯著高于脂肪肝患者[（12.22±5.13）、（10.42±4.27）比（1.25±0.77）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），而AIH患者和乙肝患者iNOS相對表達(dá)量的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AIH患者和乙肝患者肝組織 IL-1β相對表達(dá)量顯著高于脂肪肝患者[（5.90±3.01）、（12.19±3.71）比（1.76±1.42）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義（P均<0.05），乙肝患者肝組織 IL-1β的相對表達(dá)量顯著高于AIH患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）健康對照者對于相同劑量的乳果糖、甘露醇耐受差，應(yīng)注重探索一個(gè)檢測敏感、耐受良好的實(shí)驗(yàn)劑量。健康對照組無腸屏障功能的改變，肝硬化患者確有 L/M值的增大、腸屏障功能的改變，與前兩者相比本研究似傾向于提示AIH患者腸屏障功能尚正常，但未來應(yīng)在優(yōu)化方法的基礎(chǔ)上擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。（2）AIH