月月桂香精油提取研究及其調控基因AACT克隆技術.pdf

1、月月桂花香淡雅，微黃，四季開花，但其花量少，即使處于盛花階段，花量也比同類花量少。月月桂花香是眾多桂花中最淡的，幾乎聞不到花香味，這限制了其觀賞及商業(yè)應用。因此雖然桂花香精油廣泛應用于醫(yī)藥和食品產(chǎn)業(yè)，而月月桂精油的提取及商業(yè)應用卻不常見。
　　本研究發(fā)現(xiàn)月月桂香氣較淡、香氣成分時空表達差異具有較大的缺點，探索月月桂精油提取的最佳工藝，探索月月桂精油工業(yè)化提取的可能性，以月月桂精油提取量為衡量指標，優(yōu)化月月桂石油醚萃取法提取工藝，得

2、到最佳的提取條件。針對月月桂花香較淡的缺點，本研究通過克隆月月桂乙酰輔酶A?；D移酶(acetyl-CoAC-acetyltransferase，AACT)基因全長，并對其進行生物信息學分析，并試圖構建AACT植物表達載體，為改善月月桂香氣較淡、香氣成分時空表達差異探索一條可行的道路。本文還研究了月月桂時空表達特點，為AACT植物表達載體轉化受體植物提供理論支撐。實驗的主要結果如下:
　　1.利用石油醚萃取月月桂香精油，其最佳提取

3、工藝為:粉碎至20目，料液比為1∶5m/v，提取溫度為60℃，提取4h。通過GC-MS技術分析檢測香精油的香型成分，發(fā)現(xiàn)香氣成分以醇類、酯類、酸類等物質為主，其中萜類物質占了85％以上，所有成分中角鯊烯的含量最高，為11.5986％，其中的單帖類物質如α-蒎烯、β-羅勒烯、水芹烯、莰烯、芳樟醇等的含量達到16.5957％，而紫羅蘭酮和4-羥基-β-紫羅酮香的含量為12.1328％。
　　2.采用RACE技術克隆香精油成分的合成關鍵

4、酶一乙酰輔酶A酰基轉移酶(AACT)的基因，得到的cDNA序列長為1580bp，并對此基因進行生物信息學分析，月月桂AACT開放閱讀框在80～1297 bp之間，共編碼405個氨基酸;相對分子質量為41347.89 D;等電點為5.66，為疏水性穩(wěn)定蛋白，屬Cond-enzymes超家族，氨基酸序列比對和進化樹分析都可以發(fā)現(xiàn)，AACT的保守性高，具有可靠性。
　　3.采用AACT基因的半定量表達分析觀察AACT基因的組織特異性表達

5、和時空差異表達，分析AACT在月月桂花瓣和葉子中不同季度的表達量水平及不同花期的表達量?；虮磉_半定量分析結果顯示:春夏秋冬四季中月月桂花瓣中AACT的表達量相似度達99％，AACT表達量均為1.0241左右，上下偏差不超過0.0201;月月桂葉子中AACT的表達量隨著季節(jié)的轉換逐漸降低，AACT量從3月份的0.7740一直降為0.1200;同一季節(jié)，月月桂花瓣中AACT的表達量遠遠高于葉子中AACT的表達量，且隨著季節(jié)變化差距越來越大

6、，3、6、9、12月份月月桂花和葉子的AACT表達量差距分別在0.3、0.4、0.6、0.9，顯著性明顯;不同開花期的AACT的表達量相差較大，初花期的月月桂花瓣AACT表達量最高，AACT表達量為0.9左右，而凋謝期中AACT表達量最低為0.4左右。
　　4.利用BamH1-Kpn1雙酶切和T4連接酶，將1218bp的AACT基因插入11633bp的pCMBIA2301質粒中，得到CaMV35s啟動子驅動的OsAACT表達的植物