胰島素抵抗及糖尿病大鼠心房肌細(xì)胞電生理學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　目前糖尿病(DM)在全世界普遍流行，特別是在經(jīng)濟(jì)急速發(fā)展的我國(guó)，已然成為一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。最新的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)DM可能為心房纖顫(Af)的誘因，盡管研究結(jié)果缺乏嚴(yán)格的一致性。2011年Rachel R等人在前人研究的基礎(chǔ)上，收集數(shù)篇關(guān)于糖尿病與房顫關(guān)系的前瞻性隊(duì)列研究及病例對(duì)照研究進(jìn)行了薈萃分析，研究得出了較為信服的結(jié)論:糖尿病是房顫發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。胰島素抵抗與糖尿病密切相關(guān)，其不僅表現(xiàn)為代謝紊

2、亂引起代謝綜合征，還可導(dǎo)致一系列心血管事件。有意思的是，一個(gè)隨訪長(zhǎng)達(dá)10年的隊(duì)列研究表明，胰島素抵抗患者房顫的發(fā)生率并未增加.
　　現(xiàn)有研究表明，糖尿病發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了電生理重構(gòu)，主要表現(xiàn)為動(dòng)作電位形態(tài)改變，這些改變?cè)黾恿酥滦穆墒С５囊赘行?。離子通道改變是電重構(gòu)的基礎(chǔ)，心肌細(xì)胞有眾多離子通道:快鈉通道（the fast Na+ current，INa）主要介導(dǎo)動(dòng)作電位的觸發(fā);瞬時(shí)外向鉀電流（the transient ou

3、tward K+ current，Ito）主要負(fù)責(zé)動(dòng)作電位的快速?gòu)?fù)極;L型-鈣通道(L-Type Ca2+ current，ICa-L)主要負(fù)責(zé)動(dòng)作電位平臺(tái)期的內(nèi)向電流，而內(nèi)向整流鉀電流（inward rectifier K+ current，IK1）主要負(fù)責(zé)靜息電位的維持及復(fù)極晚期的調(diào)整。
　　既往的研究表明:糖尿病患者的心電圖具有較大的變異性及異質(zhì)性，如P波延長(zhǎng)、P波離散度增加等。上述異常提示糖尿病患者心房可能存在除極障礙，導(dǎo)

4、致沖動(dòng)的產(chǎn)生或傳導(dǎo)異常。心電圖P波代表心房的除極波，既往的研究表明P波延長(zhǎng)與左房擴(kuò)大、左房功能及隨后房顫的發(fā)生密切相關(guān)。先前已有學(xué)者經(jīng)發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠心房傳導(dǎo)速度明顯降低。另外，糖尿病患者體表心電圖P波離散度增加獨(dú)立于缺血、高血壓及左室肥厚等因素。盡管如此，糖尿病P波延長(zhǎng)的可能機(jī)制目前仍不清楚。我們推測(cè)糖尿病心肌病變中心房肌細(xì)胞可能存在離子通道重構(gòu)，但具體哪些離子通道受到影響目前仍不清楚，這對(duì)于將來(lái)治療糖尿病合并房顫進(jìn)行抗心律失常藥物

5、選擇時(shí)極關(guān)重要。另外，作為糖尿病早期階段，即“胰島素抵抗”狀態(tài)下心房肌電生理學(xué)的特點(diǎn)目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，在此我們一并研究。這有利于動(dòng)態(tài)觀察從胰島素抵抗發(fā)展到2型糖尿病期間的離子流變化，明確發(fā)生電生理重構(gòu)的時(shí)間段，從而建立一個(gè)較為全面的離子機(jī)制。
　　綜合上述研究現(xiàn)狀，本研究主要分三部分進(jìn)行探討。首先，建立大鼠胰島素抵抗及糖尿病模型，探討糖尿病大鼠心房肌細(xì)胞急性分離的方法。其次，采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)糖尿病階段心房肌細(xì)胞INa及IK1

6、，并檢測(cè)糖尿病大鼠左房大小及纖維化程度。另外，分析心房縫隙連接蛋白Cx40及Cx43的表達(dá)及分布情況，探討糖尿病P波延長(zhǎng)的可能機(jī)制。最后，采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)胰島素抵抗及糖尿病心房肌細(xì)胞的電生理學(xué)變化，并檢測(cè)相關(guān)離子通道蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)上述的研究，我們有可能發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠P波延長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)，并可動(dòng)態(tài)觀察從胰島素抵抗發(fā)展到糖尿病階段心房肌細(xì)胞電生學(xué)演變的特點(diǎn)。由于物種差異，Wistar大鼠的心肌細(xì)胞擁有大量的Ito，幾乎沒(méi)有Ik，因此我

7、們?cè)谘芯科潆x子機(jī)制時(shí)集中在INa(Nav1.5)，Ito(Kv4.2、Kv4.3及Kv1.4)，IK1（Kir2.1），ICa-L(Cav1.2)這幾個(gè)通道。
　　方法：
　　一、糖尿病心房肌細(xì)胞急性分離方法的探討
　　健康雄性Wistar大鼠，高脂高糖飲食6周后小劑量STZ腹腔注射建立糖尿病模型。8周后檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素水平，計(jì)算“胰島素穩(wěn)態(tài)評(píng)價(jià)指數(shù)”。采用Langendorff灌流裝置及改良的灌流法提取心房肌

8、細(xì)胞，采用形態(tài)學(xué)及免疫熒光對(duì)心房肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用膜片鉗技術(shù)記錄心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位。
　　二、糖尿病誘導(dǎo)P波延長(zhǎng)機(jī)制的探討
　　健康雄性Wistar大鼠，高糖高脂飲食合并STZ腹腔注射建立糖尿病模型，8周后檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素水平，計(jì)算“胰島素穩(wěn)態(tài)評(píng)價(jià)指數(shù)”。最終共納入對(duì)照組15只，糖尿病組20只。大鼠心房肌細(xì)胞急性分離，膜片鉗技術(shù)檢測(cè)INa及IK1，模擬標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)記錄并分析P波時(shí)限，心臟二維超聲檢測(cè)左房舒張末前后徑(

9、LADd)。Western-blot檢測(cè)Cx40及Cx43蛋白表達(dá)情況，免疫熒光檢測(cè)Cx40及Cx43蛋白分布情況，Masson染色檢測(cè)心肌纖維化程度。探討糖尿病誘導(dǎo)P波延長(zhǎng)的可能機(jī)制。
　　三、從胰島素抵抗發(fā)展至糖尿病心房肌細(xì)胞電生理學(xué)變化的研究
　　健康雄性Wistar大鼠，單純高糖高脂飲食建立胰島素抵抗模型，采用“高胰島素----正糖鉗夾技術(shù)”檢測(cè)胰島素抵抗存在。采用高糖高脂飲食合并STZ腹腔注射建立糖尿病模型。腹腔注

10、射STZ8周后檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素水平，計(jì)算“胰島素穩(wěn)態(tài)評(píng)價(jià)指數(shù)”。最終納入對(duì)照組15只、胰島素抵抗組15只及糖尿病組20只。糖尿病病程8周時(shí)，急性分離大鼠心房肌細(xì)胞，膜片鉗技術(shù)檢測(cè)INa、 IK1、Ito、 ICa-L及APD。采用western-blot檢測(cè)Nav1.5、Kv4.2、Kv4.3、Kv1.4、Kir2.1及Cav1.2的蛋白表達(dá)情況，動(dòng)態(tài)觀察從胰島素抵抗發(fā)展至糖尿病期間心房肌電生理重構(gòu)的演變情況。
　　結(jié)果：

11、
　　1、高糖高脂飲食及小劑量STZ腹腔注射可建立穩(wěn)定的2型糖尿病模型。改良的灌流法可獲得梭形、耐鈣的心房肌細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果顯示心房肌細(xì)胞Kv1.5離子通道蛋白陽(yáng)性。膜片鉗檢測(cè)結(jié)果提示該方法提取的心房肌細(xì)胞能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位。
　　2、糖尿病誘導(dǎo)P波延長(zhǎng)（19.95±0.41 vs.17.40±0.47 ms;P＜0.05），兩組間LADd無(wú)明顯差異(4.51±0.04mmvs.4.41±0.05 mm，P＞0.05).膜片

12、鉗結(jié)果顯示兩組間心房肌細(xì)胞INa及IK1最大電流密度無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，糖尿病組Cx40表達(dá)明顯下調(diào)，而Cx43則無(wú)明顯變化。Cx40組織間分布稀疏，Cx43出現(xiàn)側(cè)面化分布。Masson染色顯示，糖尿病組心房肌纖維化程度較對(duì)照組明顯加重。
　　3、糖尿病心房肌細(xì)胞APD較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，而胰島素抵抗心房肌細(xì)胞APD較對(duì)照組無(wú)明顯差異。三組間靜息電位、動(dòng)作電位幅度均無(wú)明顯差異。三組間INa最大電流密度無(wú)明顯差異。胰島素抵抗組心

13、房肌細(xì)胞IK1于-150mv處電流密度較對(duì)照組及糖尿病組明顯增大。糖尿病組大鼠心房肌細(xì)胞Ito最大電流密度較對(duì)照組明顯降低，而胰島素抵抗組則無(wú)明顯變化。胰島素抵抗組ICa-L最大電流密度較對(duì)照組明顯降低，糖尿病組則進(jìn)一步降低。相應(yīng)的western-blot結(jié)果顯示，三組間Kir2.1、Nav1.5蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，糖尿病組Kv4.2、Kv4.3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Kv1.4蛋白明顯上調(diào)，而胰島素抵抗組Kv4.2、Kv4.3及Kv1.4則

14、無(wú)明顯變化。胰島素抵抗組Cav1.2蛋白表達(dá)降低，而糖尿病組則進(jìn)一步降低。
　　結(jié)論：
　　1、改良的灌流法適用于糖尿病大鼠心房肌細(xì)胞的急性分離，有助于糖尿病心房肌細(xì)胞的電生理研究
　　2、糖尿病P波延長(zhǎng)可能與Cx40表達(dá)下調(diào)、Cx43側(cè)面化分布及纖維化程度加重有關(guān)，與心房大小無(wú)關(guān)
　　3、糖尿病早期，即胰島素抵抗階段即存在離子通道重構(gòu)。糖尿病心房肌電生理重構(gòu)較胰島素抵抗更為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為復(fù)極障礙，而除極基本不