hstK基因家族的pkn44和pkn30在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120異形胞特異性糖脂合成中的作用.pdf

1、魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120是一種絲狀藍(lán)細(xì)菌，在培養(yǎng)基中缺乏化合態(tài)氮源的條件下，其菌絲上約5-10％的細(xì)胞會分化成異形胞。異形胞為生物固氮提供場所，并將固定的氮源傳遞給臨近的營養(yǎng)細(xì)胞，以維持整條菌絲的生長。由于氧氣可以使固氮酶不可逆失活，異形胞采取了3種措施來創(chuàng)造無氧環(huán)境，以保護(hù)固氮酶：首先，其胞外覆蓋有由外層的多糖層和內(nèi)層的糖脂層組成的包被，以限制氧氣的進(jìn)入；其次，異形胞不具有完整的PSⅡ，喪失了光合放氧的能力；此外，異形胞內(nèi)的呼吸作用大

2、大加強(qiáng)。異形胞的分化過程分為不同的階段并且經(jīng)歷了復(fù)雜的形態(tài)變化，大量信號傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)參與其中。 在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120中，存在一類命名為hstK的基因家族，擁有13個成員。該家族的特點是，在其編碼蛋白質(zhì)的氨基端具有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，而羧基端具有一個組蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。在本研究中，對hstK基因家族的2個成員pkn44和pkn30的功能進(jìn)行了探討。 pkn44和pkn30的雙突變體D4.3不能在缺乏化合態(tài)

3、氮源的條件下維持生長，在缺氮誘導(dǎo)24hr時，觀察不到異形胞的分化，而在缺氮誘導(dǎo)48hr時，可以觀察到一些以異形胞模式分布的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以被使異形胞特異性多糖著色的阿爾新藍(lán)染色(Het+表型)。這表明，D4.3的異形胞發(fā)育出現(xiàn)了延遲并停滯在了較早的階段。乙炔還原法測定固氮酶活性結(jié)果表明，在環(huán)境中存在氧氣時，D4.3喪失了固定N2的能力；但是，當(dāng)環(huán)境處于微氧狀態(tài)時，D4.3能夠表現(xiàn)出微弱的固氮酶活性(Fix+表型)。WesternBlo

4、tting結(jié)果與固氮酶活性測定結(jié)果一致，在有氧條件下，D4.3中檢測不到NifH的存在，只有在微氧條件下，才能在D4.3中檢測到少量的NifH。RT-PCR和實時定量RT-PCR結(jié)果也顯示，D4.3中只有在微氧條件下才能檢測到微弱的nifH的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果暗示，D4.3仍具有轉(zhuǎn)錄并表達(dá)NifH的能力，它在有氧條件下表現(xiàn)出來的種種異常很有可能是受到高水平細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度的侵害，換而言之，D4.3分化出的不成熟的異形胞可能并不具備有效隔離氧氣

5、的能力。對D4.3的電子顯微鏡觀察結(jié)果支持這一推論，在D4.3的異形胞外，沒有觀察到完整的異形胞包被，本應(yīng)位于內(nèi)層的糖脂層并不存在，而外層的多糖層也較野生型稀薄。薄層層析分析表明，D4.3只能合成異形胞特異性糖脂中的1-(α-D-葡萄糖)-3,25-二十六烷基二醇而不能合成1-(α-D-葡萄糖)-3-酮基-25-二十六烷醇。隨后通過RT-PCR和實時定量RT-PCR對D4-3中部分糖脂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，這些基因的轉(zhuǎn)錄在

6、D4.3中受到了不同程度的影響。 在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120中，prpJ也是一個只參與一種異形胞特異性糖脂合成的基因，它編碼PP2C類蛋白磷酸酶。其突變體可以合成1-(α-D-葡萄糖)-3-酮基-25-二十六烷醇，而不能合成1-(α-D-葡萄糖)-3,25-二十六烷基二醇。prpJ2是prpJ的同源基因，同樣編碼一個PP2C類蛋白磷酸酶。prpJ2的突變并不影響菌體在缺氮條件下的生長和異形胞分化，但是，prpJ2和prpJ同時突

7、變的雙突變體S19/S20喪失了分化異形胞的能力。實時定量RT-PCR結(jié)果顯示，prpJ2在缺氮后上調(diào)表達(dá)，而這種上調(diào)表達(dá)在ntcA突變體中觀察不到，這暗示，prpJ2可能處于NtcA的調(diào)控之下。EMSA實驗結(jié)果支持這一推論，在prpJ2編碼區(qū)上游發(fā)現(xiàn)的。NtcA結(jié)合位點可以在體外與NtcA相結(jié)合。此外，實時定量RT-PCR結(jié)果表明，突變體S19/S20中hetR的表達(dá)量在缺氮后不能維持上調(diào)表達(dá)，這有可能是其不能分化異形胞的原因。因此，