慢病毒介導的C-jun基因沉默對放射抗拒人鼻咽癌胞系CNE-2R放射敏感性的影響.pdf

1、背景：
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種好發(fā)于東南亞地區(qū)及我國南方各省的常見惡性腫瘤[1]。鼻咽癌患者放療后局部的復發(fā)以及遠處轉移是制約其療效和預后的瓶頸，放射抗拒是制約鼻咽癌患者5年生存率的關鍵因素[2，3]。有研究表明，輻射誘導的基因調控和表達的差異可能與放射抗拒的發(fā)生有關[4-7]。因此，尋找能夠早期預測鼻咽癌輻射敏感性的分子標志物對于個體化放射治療具有重要意義。
　　本課題

2、組將前期篩選出與放射抗拒相關的分子標志物進行基因本體論(gene ontology)、通路分析(Pathway analysis)及蛋白質互做網(wǎng)絡技術(Protein interaction network)進行綜合分析，從放射抗拒相關基因或蛋白質互做網(wǎng)絡中獲取多個與輻射抗拒相關的關鍵性標志物。
　　我們選取在通路構建網(wǎng)絡上的節(jié)點之一的c-jun作為候選基因，為明確c-jun基因與鼻咽癌放射抗拒之間的相關性，我們利用RNA干擾技術

3、抑制放射抗拒人鼻咽癌細胞系CNE-2R中高表達的c-jun基因，探究其對CNE-2R細胞放射敏感性的影響及其潛在機制。初步探討c-jun基因能否成為鼻咽癌分子治療的新靶點。
　　研究內容
　　第一部分 慢病毒shRNA載體構建并建立穩(wěn)定轉染的CNE-2R細胞株
　　目的：
　　本課題組前期發(fā)現(xiàn)c-jun基因在放射抗拒細胞株CNE-2R中呈高表達，因其涉及多條通路且是基因互作網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點之一，為明確c-jun基

4、因與鼻咽癌放射抗拒之間的相關性，我們利用RNAi抑制放射抗拒人鼻咽癌細胞系CNE-2R中高表達的c-jun基因，并篩選穩(wěn)定表達的細胞株，為探究其對CNE-2R細胞放射敏感性的影響奠定基礎。
　　方法：
　　1.采用RT-PCR及Western blot實驗分別在mRNA及蛋白水平上驗證c-jun基因的表達。
　　2.設計合成3組特異性針對c-jun基因的siRNA，構建慢病毒shRNA載體，感染CNE-2R細胞。

5、>　　3.將感染目的細胞CNE-2R，經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細胞株，采用RT-PCR和Western blot實驗檢測各組對目的基因的抑制效果，篩選出沉默效果最佳的靶點。
　　結果：
　　1.RT-PCR和Western blot實驗檢測c-jun基因的表達情況與芯片結果相符。
　　2.經(jīng)測序證實，3組特異性針對c-jun基因的siRNA，成功構建慢病毒shRNA載體，并包裝出滴度為8×108TU/ml。感染CNE-2R

6、細胞，熒光倒置顯微鏡下觀察，顯示各組感染效率均在80％以上，感染成功。
　　3.RT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾靶點，siRNA序列為:CA AACCTCAGCAACTTCAA。
　　結論：
　　RNA干擾技術可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌細胞系CNE-2R中高表達的c-jun基因，為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　第二部分 慢病毒介導的C-jun基因沉默對放射抗拒人
　　鼻咽癌CNE-2R細胞生物

7、學行為及放射敏感性的影響
　　目的：利用RNA干擾技術抑制放射抗拒人鼻咽癌細胞系CNE-2R中高表達的c-jun基因，觀察c-jun基因沉默后對CNE-2R細胞的存活能力、周期、凋亡及放射敏感性的影響，了解c-jun基因與鼻咽癌放射敏感性間的相關性。
　　方法：
　　1.CCK-8實驗檢測感染前后細胞的生長情況，分析c-jun基因沉默前后對CNE-2R細胞生存率的影響。
　　2.克隆形成實驗測定c-jun基因沉默

8、前后，CNE-2R細胞放射敏感性的變化。
　　3.流式細胞術檢測經(jīng)0 Gy和2 Gy處理后各組細胞周期及凋亡率的變化，分析c-jun基因沉默后對CNE-2R細胞周期及凋亡的影響。
　　結果：
　　1.CCK-8實驗結果顯示:6MVX射線聯(lián)合c-jun基因沉默組在0、2、4、6和8 Gy照射后細胞的吸光度OD值均顯著低于未轉染組和陰性對照組(F=42.70～200.67,P＜0.05)。
　　2.克隆形成實驗顯示，

9、c-jun基因沉默組與未轉染組及陰性對照組相比，SF2、D0和Dq值均減小，放射增敏比(SERD0)為1.41。
　　3.細胞周期結果顯示:0Gy:未轉染組、NC組和c-jun-RNAi-LV2實驗組G2/M所占比例分別為18.27±5.28，17.13±3.35，27.33±1.58，c-jun基因沉默組與另兩組相比G2/M所占比例增加(P＜0.05);2Gy:三組G2/M所占比例分別為19.93±4.99，17.63±3.01

10、，28.57±2.9(P＜0.05)。
　　4.細胞凋亡實驗結果顯示，未經(jīng)照射的c-jun基因沉默組與聯(lián)合2 Gy照射的凋亡率分別為（20.93±1.99）％和（38.17±0.83）％，均高于未轉染組和陰性對照組的凋亡率[0 Gy:（10.97±0.70）％和（10.80±1.25）％;2 Gy:（20.43±0.25）％和（19.53±1.50）％;F=50.54、330.14，P＜0.05]。
　　結論：
　　c