厚樸酚對(duì)戊四氮致癇大鼠的保護(hù)作用及bcL-2、bax在大鼠海馬中的表達(dá)變化.pdf

1、目的:癲癇是由不同癥狀和體征組成的具有發(fā)作性、短暫性和刻板性的慢性神經(jīng)系統(tǒng)腦功能障礙綜合征。流行病學(xué)調(diào)查顯示癲癇的發(fā)病率為5‰-7‰，我國(guó)目前約有650萬(wàn)-910萬(wàn)癲癇患者，其中青少年和老年是癲癇發(fā)病的兩個(gè)高峰年齡段。目前癲癇的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，但癲癇發(fā)病過(guò)程中的一些重要環(huán)節(jié)已被研究人員所掌握。目前人們認(rèn)為癲癇可能的發(fā)病機(jī)制有興奮性氨基酸毒性學(xué)說(shuō)、ATP耗竭、鈣超載、氧化應(yīng)激、致炎因子損傷以及細(xì)胞凋亡等。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

2、，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用。癲癇發(fā)作后會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，研究發(fā)現(xiàn)這與細(xì)胞凋亡通路的失衡和紊亂密切相關(guān)。Bel-2蛋白質(zhì)家族是細(xì)胞凋亡通路上控制線粒體致凋亡因子釋放的主要調(diào)節(jié)因子。其中Bcl-2作為凋亡抑制因子，具有強(qiáng)有力的抗細(xì)胞凋亡作用，從而延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，而B(niǎo)ax是該家族中最重要的凋亡誘導(dǎo)因子，兩者的相互作用決定了細(xì)胞的存活。
　　厚

3、樸酚(Magnolol)是一種從木蘭科落葉喬木植物厚樸(Magnoliaofficinalis)中提取的聯(lián)苯二酚復(fù)合物，廣泛應(yīng)用于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中。研究表明其具有清除自由基、抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、抗炎、抑制血小板聚集、抗病原微生物、鎮(zhèn)靜、肌松及抗凋亡等藥理作用。其作為一種潛在的神經(jīng)保護(hù)劑，對(duì)腦血管病、癲癇、認(rèn)知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的治療作用的研究也越來(lái)越多的受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病均具有抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

4、　　本實(shí)驗(yàn)采用成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，通過(guò)腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)建立起穩(wěn)定的慢性癲癇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并給予厚樸酚干預(yù)，觀察干預(yù)后大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度及持續(xù)時(shí)間，同時(shí)觀察各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。運(yùn)用HE染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué)，運(yùn)用透射電鏡觀察神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化，運(yùn)用Western Blot方法觀察大鼠海馬組織細(xì)胞中指標(biāo)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)情況，進(jìn)而研究PTZ致癇大鼠

5、癲癇模型中，厚樸酚的腦保護(hù)及抗癲癇作用，并探究其可能存在的作用機(jī)制。
　　方法:將75只6-8周體重180-220g清潔級(jí)SD成年雄性大鼠隨機(jī)分為:正常對(duì)照組（NC組）、癲癇組（PTZ組）、厚樸酚低級(jí)量組（L組）、厚樸酚中劑量組（M組）、厚樸酚高級(jí)量組（H組），每組各15只大鼠。（實(shí)驗(yàn)中，若有大鼠死亡，則及時(shí)補(bǔ)足）。自實(shí)驗(yàn)第一天起，每天上午9:00開(kāi)始腹腔注射藥物。NC組:每日腹腔注射丙二醇1ml/kg，30min后給予腹腔注射生

6、理鹽水3.5 ml/kg，觀察1小時(shí)，共42天。PTZ組:每日腹腔注射丙二醇1ml/kg，30min后給予腹腔注射1％PTZ35mg/kg，觀察1小時(shí)，共42天。L組:每日腹腔注射厚樸酚2.5mg/kg，30min后給予腹腔注射1％PTZ35mg/kg，觀察1小時(shí)，共42天。M組:每日腹腔注射厚樸酚5mg/kg，30min后給予腹腔注射1％PTZ35mg/kg，觀察1小時(shí)，共42天。H組:每日腹腔注射厚樸酚10mg/kg，30min后給

7、予腹腔注1％PTZ35mg/kg，觀察1小時(shí)，共42天。打藥后依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察大鼠癲癇發(fā)作等級(jí)、持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24小時(shí)，每組取6只大鼠灌注取腦，用HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響，另取3只大鼠灌注取腦后用透射電鏡學(xué)方法檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)的變化，剩余每組6只大鼠，斷頭取腦，生理鹽水中快速分離海馬，用Western Blot方法檢測(cè)海馬bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　

8、　1行為學(xué)結(jié)果觀察正常對(duì)照組:大鼠行為正常，飲食規(guī)律，體重正常增加，毛發(fā)光澤，無(wú)癲癇發(fā)作。癲癇組:體重基本無(wú)明顯變化或減輕，大鼠進(jìn)食較差，活動(dòng)減少，戊四氮腹腔注射后4-7天相繼出現(xiàn)點(diǎn)頭、洗臉、甩尾、一側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣，隨后從10-15天起，相繼發(fā)展成全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作伴站立、摔倒，最終達(dá)到Ⅳ-Ⅴ級(jí)發(fā)作，大鼠連續(xù)三次RacineⅣ-Ⅴ級(jí)發(fā)作后被認(rèn)為點(diǎn)燃成功，截止到實(shí)驗(yàn)終止PTZ組共14只大鼠點(diǎn)燃成功，點(diǎn)燃率為93.3％。厚樸酚低劑量組:

9、大鼠體重略有增加，飲食及活動(dòng)尚可，發(fā)作強(qiáng)度較癲癇組減輕，潛伏期延長(zhǎng)（18-27天），大部分發(fā)作級(jí)別為Ⅱ-Ⅲ級(jí)，且Ⅳ-Ⅴ級(jí)發(fā)作不能連續(xù)出現(xiàn)，共5只點(diǎn)燃成功，點(diǎn)燃率為33.3％。厚樸酚中劑量組:大鼠體重有所增加，飲食及行為接近正常，發(fā)作強(qiáng)度較癲癇組及低劑量組減輕，大部分發(fā)作級(jí)別為Ⅱ-Ⅲ級(jí)，且發(fā)作的潛伏期延長(zhǎng)（20-28天），僅1只點(diǎn)燃成功，點(diǎn)燃率為6.7％。厚樸酚高劑量組:大鼠體重降低，進(jìn)食稍差，活動(dòng)減少。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有3只大鼠死亡（非癲癇發(fā)

10、作所致），給予補(bǔ)充后統(tǒng)計(jì)厚樸酚高劑量組的點(diǎn)燃率為13.3％（死亡大鼠數(shù)量未計(jì)算在內(nèi)）。
　　2 HE染色結(jié)果正常對(duì)照組:大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)完整，錐體細(xì)胞排列規(guī)則緊密，細(xì)胞數(shù)正常，沒(méi)有明顯的神經(jīng)元缺失。胞核和胞漿比例正常，核仁清晰可見(jiàn)。癲癇組:與對(duì)照組比較，大鼠海馬神經(jīng)元丟失明顯，排列紊亂，細(xì)胞邊界不清晰，神經(jīng)元呈嗜酸性細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集成塊，核固縮。厚樸酚低劑量組、厚樸酚中劑量組:與對(duì)照組比較，厚樸酚干預(yù)后海馬細(xì)胞組

11、織神經(jīng)元邊界清楚，形態(tài)趨于正常，細(xì)胞數(shù)量與癲癇組相比明顯增加，神經(jīng)元沒(méi)有明顯丟失，只有一小數(shù)量的嗜酸性粒細(xì)胞.厚樸酚高級(jí)量組:海馬神經(jīng)元分布紊亂，邊界不清，神經(jīng)元丟失較多，但較癲癇組為好。
　　3 Western blot檢測(cè)結(jié)果大鼠海馬bcl-2表達(dá)水平癲癇組較正常對(duì)照組、厚樸酚低劑量組、厚樸酚中劑量組、厚樸酚高級(jí)量組明顯降低(P＜0.05);bax蛋白癲癇組較正常對(duì)照組、厚樸酚低劑量組、厚樸酚中劑量組、厚樸酚高級(jí)量組明顯升高(

12、P＜0.05）;厚樸酚中劑量組bcl-2表達(dá)水平較低劑量組及高級(jí)量組明顯升高(P＜0.05)，bax表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。
　　4透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化正常對(duì)照組電鏡觀察:神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰。胞核圓形，染色質(zhì)分布均勻。線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體含量豐富，結(jié)構(gòu)完整。線粒體呈圓形或橢圓形，嵴清晰可見(jiàn)。軸突中神經(jīng)微絲微管清晰可見(jiàn)。癲癇組電鏡觀察:海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞，胞核腫脹，形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)減少分散

13、，有些出現(xiàn)核固縮。線粒體空泡化，嵴斷裂明顯，神經(jīng)微絲微管結(jié)構(gòu)不清晰。厚樸酚低劑量組及中劑量組:海馬神經(jīng)元形態(tài)完整，核形態(tài)基本正常，染色質(zhì)分布均勻，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)接近正常。厚樸酚高劑量組:海馬神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，胞核腫脹、疏松，核內(nèi)染色質(zhì)出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，線粒體腫脹，嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。
　　結(jié)論:
　　1厚樸酚可有效抑制戊四氮致癇大鼠的癲癇發(fā)作，并且降低癲癇發(fā)作級(jí)別。
　　2癲癇后可引起細(xì)胞凋亡，使抗凋亡蛋白bcl-2