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文檔簡介
1、干燥綜合征(sjogren's syndrome,SS)是以口眼干燥、淚液唾液分泌減少,可累及多臟器為臨床表現(xiàn),以淋巴細胞高度浸潤為病理特點的彌漫性結締組織病,分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren'ssyndrome PSS)從發(fā)病到病變遷延的基礎是免疫功能紊亂,外分泌腺管道上皮細胞可發(fā)揮抗原遞呈作用,細胞識別抗原后T、B細胞增殖,促使B細胞分化為漿細胞,進而產(chǎn)生大量免疫球蛋白、自身抗體,導致體液免疫過度
2、的異常反應,聚集大量的各種細胞因子和炎癥介質造成組織損傷。
在此過程中有一類CD4+T細胞亞群,輔助B細胞,以趨化因子受體CXCR5為主要表面標志物,高表達特異性ICOS、BCL-6、CD40、PD-1,分泌IL-21發(fā)揮其生物學功能,起著不可或缺的作用,這類細胞稱為濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell,Tfh cell)。
目的:目前,國內外對Tfh細胞在SS中致病作用研究仍不是很全面
3、,本文主要是通過流式細胞術(flow cytometry FCM)檢測外周血CD4+CXCR5+T細胞表達率,實時定量PCR(RT-PCR)檢測外周血CXCR5、ICOS mRNA的表達量,免疫組織化學方法(Immunohistochemical IHC)檢測唇腺組織中ICOS、Bcl-6蛋白的表達情況及定位,探討Tfh細胞在干燥綜合征發(fā)病過程中其數(shù)量及生物學功能發(fā)生異常的表現(xiàn)。
方法:
1、選取河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院
4、免疫風濕科2014年1月至2015年1月PSS患者30例作為PSS組,男性2例,女性28例,年齡范圍40~65歲之間,平均年齡(50.47±9.96)歲,其中無系統(tǒng)損害患者20例,伴肺間質纖維化患者2例,肺動脈高壓患者1例,免疫性血小板減少患者5例,腎小管酸中毒患者2例,入組前均未應用激素、免疫抑制劑等藥物治療。
1.1流式細胞分析(FCM):30例PSS患者作為PSS組,20例健康志愿者作為健康對照組,晨起空腹采外周靜脈血1
5、ml,肝素鈉抗凝,采用流式細胞術檢測CD4+CXCR5+T細胞百分率,比較兩組間的差異及與臨床指標的相關性。
1.2實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR):30例PSS患者作為PSS組,20例健康志愿者作為健康對照組,晨起空腹采外周靜脈血5ml,EDTA抗凝的,用Real Time PCR方法檢測PSS組和健康對照組外周血CXCR5mRNA、ICOS mRNA表達量的變化情況。通過引物設計、提取樣本總RNA、逆轉錄合成cDNA
6、,RT-PCR反應體系的建立,獲得各樣本實時擴增曲線圖和樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線圖,計算出各樣本基因相對定量分析結果。
1.3免疫組織化學法(IHC):PSS患者唇腺組織為研究標本,共30例,同時選取下唇外傷、粘膜下囊腫等非自身免疫性疾病患者20例作為對照組,所有研究對象的唇腺腺泡組織標本均由4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,HE染色,免疫組織化學方法檢測標本中ICOS、Bcl-6蛋白的表達及定位,以淋巴細胞浸潤不同等級為觀察基石,顯微
7、鏡下觀察兩組間、等級間ICOS、Bcl-6蛋白的表達、定位的差異,與淋巴細胞、漿細胞及正常唇腺組織間的相關性,以及與生發(fā)中心的形成可能存在的聯(lián)系。
2、臨床指標歸納:回顧并總結PSS患者臨床指標,包括免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、血沉(ESR)、抗SSA/SSB抗體等,并與本實驗所檢測指標進行相關性分析。
3統(tǒng)計學分析:采用SPSS21.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,一般數(shù)據(jù)資料以((x)±s)表示;兩個獨立樣本
8、比較服從正態(tài)分布,采用t檢驗,不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(U檢驗);多個獨立樣本比較服從正態(tài)分布采用方差分析,不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(H檢驗),計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。兩變量間的相關性分析,如服從正態(tài)分布采用pearson相關系數(shù),不服從正態(tài)分布采用spearman相關系數(shù)。以檢驗水準α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果:
1、FCM:PSS患者外周血中CD4+CXCR5+T細胞占CD4+T細胞
9、百分率顯著高于正常對照組,且有統(tǒng)計學意義(16.84±6.38 vs12.85±2.38,P=0.001)。PSS組外周血中CD4+CXCR5+T細胞占CD4+T細胞百分率與臨床指標血沉(ESR)、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均無相關性(r=-0.096,P=0.614),(r=-0.280,P=0.133),(r=-0.276,P=0.139),(r=-0.287,P=0.123)??筍SA、抗SSB抗體陽性組與陰性組之間無統(tǒng)計學
10、差異(Z=-0.915,P=0.360),(Z=-1.011, P=0.312)。
2、RT-PCR: PSS組外周血CXCR5 mRNA表達明顯高于健康對照組,且有統(tǒng)計學意義(1.37±0.69 vs0.57±0.12,P=0.000)。PSS組外周血ICOSmRNA表達水平與健康對照組相比上調(1.97±0.73 vs1.54±0.58,P=0.036)。PSS組外周血中CXCR5 mRNA表達高低與臨床指標血沉ESR、免
11、疫球蛋白IgG、IgA、IgM均無相關性(r=-0.065,P=0.733),(r=-0.051,P=0.788),(r=-0.177,P=0.350),(r=-0.259,P=0.167)。與抗SSA/SSB抗體陽性組與陰性組之間無差異(Z=0.000,P=1.000),(Z=-1.571,P=0.116);
PSS組外周血中ICOS mRNA表達高低與臨床指標血沉ESR、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均無相關性(r=0.
12、024,P=0.898),(r=-0.166,P=0.382),(r=-0.266,P=0.156),(r=-0.394,P=0.031),與抗SSA/SSB抗體陽性組與陰性組之間無差異(Z=-0.665,P=0.506),(Z=-1.442,P=0.149)。
3、IHC: HE染色,顯微鏡下觀察PSS組和對照組唇腺組織結構,對照組:腺泡大小分布均勻,導管排列整齊,間質無或少量炎性細胞浸潤;PSS組:腺泡大小分布不等,可見部
13、分腺體萎縮,以導管周圍為明顯,間質散在分布或一個多個灶性淋巴細胞浸潤;免疫組化,PSS組與對照組ICOS蛋白表達水平評分分別為3.5(2,6)分,1(0,1)分,二者差異的比較有統(tǒng)計學意義(Z=-5.54,P=0.000); PSS組組織切片中導管細胞及其周圍淋巴細胞均可檢測到ICOS蛋白的表達,腺泡細胞偶可檢測到陽性細胞。經(jīng)統(tǒng)計學分析ICOS蛋白表達與導管周圍淋巴細胞浸潤程度呈顯著正相關(P=0.020),說明ICOS蛋白與淋巴細胞浸
14、潤程度有關;PSS組與對照組Bcl-6蛋白表達水平評分分別為6(2,6)分、0(0,1)分,二者差異的比較有統(tǒng)計學意義(Z=-5.70,P=0.000); PSS組組織切片中導管細胞及其周圍淋巴細胞均可檢測到Bcl-6蛋白的表達,腺泡細胞偶可檢測到陽性細胞。經(jīng)統(tǒng)計學分析Bcl-6蛋白表達與導管周圍淋巴細胞浸潤程度呈顯著正相關(P=0.001),說明Bcl-6蛋白與淋巴細胞浸潤程度有關。
4、相關性分析:PSS組外周血CD4+C
15、XCR5+T細胞的表達與外周血CXCR5 mRNA、ICOS mRNA表達水平均存在正相關性(r=0.635,P=0.000),(r=0.708,P=0.000); PSS組外周血CD4+CXCR5+T細胞的表達與唇腺組織中ICOS蛋白、Bcl-6蛋白表達水平均無相關性(r=0.031,P=0.871),(r=0.006,P=0.976); PSS組外周血CXCR5 mRNA與ICOS mRNA表達水平有相關性(r=0.665,P=0.
16、000); PSS組外周血ICOS mRNA表達水平與唇腺組織中ICOS蛋白表達水平無相關性(r=-0.044,P=0.817);疾病組唇腺組織中ICOS蛋白與Bcl-6蛋白表達水平呈正相關性(r=0.594,P=0.001)。
結論:
1、PSS患者外周血CD4+CXCR5+Tfh樣細胞占CD4+T細胞的比例明顯升高,提示Tfh細胞可能對PSS疾病的發(fā)生發(fā)展起促進作用。
2、PSS患者外周血CXCR5、I
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