KIR基因多態(tài)性、miR-146a和miR-499單核苷酸多態(tài)性與強直性脊柱炎的相關性研究.pdf

1、本文主要從以下兩個部分展開論述：
　　第一部分 KIR基因多態(tài)性與強直性脊柱炎的易感性研究
　　目的:
　　強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性炎癥性的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制目前尚不明確。除了HLA-B27之外，近幾年發(fā)現(xiàn)殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）基因與AS也存在一定的相關性。但研究結(jié)果

2、存在一定的矛盾。因此，本研究對浙南地區(qū)AS患者和健康對照的KIR基因分布進行分析，探討KIR基因在AS中的作用。
　　方法:
　　1.收集浙南地區(qū)無血緣關系的AS患者和健康對照的EDTA-K2抗凝的外周血標本，分別為99例和100例，提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。
　　2.用序列特異性引物聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction withsequence

3、-specific primers，PCR-SSP)的方法對16種KIR基因進行檢測。
　　3.根據(jù)KIR所帶基因種類和數(shù)目的不同，將KIR基因型分為抑制性基因型（AA型）和非抑制性基因型（AB型和BB型），并對KIR基因型進行編號。
　　4.計算KIR基因表型頻率、基因頻率及基因型頻率，分析AS患者和健康對照的KIR基因分布情況。用x2檢驗或者Fisher確切概率法比較AS患者和健康對照各KIR基因頻率和基因型頻率是否存在

4、差異。
　　5.計算KIR單體型頻率，用x2檢驗或者Fisher確切概率法分析其在AS患者和健康對照組之間是否存在差異。
　　結(jié)果:
　　1.所有AS患者均存在2DL1、2DL3、2DL4、3DL2、3DL3基因及假基因2DP1和3DP1。共有28種基因型，其中AA1型比例最高(35.35％)，其次為BX2型(13.13％)。
　　2.AS患者活化性基因KIR2DS3的基因頻率明顯高于健康人群(39.39％ vs

5、21％,x2=7.992,P＜0.01)。
　　3.AS患者抑制性基因型（AA型）頻率明顯低于健康人群(P＜0.05)，但兩組之間單倍體型比例不存在明顯差異(P=0.256)。
　　結(jié)論:
　　活化性基因KIR2DS3在AS患者中的表型頻率明顯高于健康對照組，且AS患者活化性和抑制性KIR基因比例失衡，出現(xiàn)免疫活化的傾向，可能與AS的發(fā)生有一定的關系。
　　第二部分 miR-146a、miR-499單核苷酸多態(tài)性

6、與強直性脊柱炎的相關性研究
　　目的:
　　miRNAs是一種能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種靶基因表達的非編碼小RNAs。在miRNA序列上的單核酸多態(tài)性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)能夠影響miRNA的表達。并且，有研究表明其與許多關節(jié)炎性疾病的致病作用有關，如類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎。miR-146a和miR-499 SNPs與AS的相關性研究目前尚未見報道，故本研究首次探討它們之間的聯(lián)

7、系，從而為AS的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集102例AS患者（未用藥物治療）及105例健康對照EDTA-K2抗凝血標本，提取DNA。
　　2.用測序法直接檢測miR-146a各SNPs(rs2910164，rs57095329、rs6864584、rs2431697、rs2277920)及miR-499 rs3746444。
　　3.用x2檢驗分析各SNPs基因型頻率分布是否符合Hardy-W

8、einberg平衡。AS患者和健康對照的基因型頻率和等位基因頻率比較采用x2檢驗或者Fisher確切概率法。采用PASS11.0計算檢驗效能。
　　4.我們采用Kruskal-Wallis H檢驗或者ANOVA檢驗對各SNP不同基因型之間的AS患者外周血中C反應蛋白(CRP)和血沉(ESR)水平進行比較，判斷不同基因型之間這兩個指標是否存在差異。
　　結(jié)果:
　　1.AS患者和健康對照各SNP基因型頻率均符合Hardy

9、-Weinberg平衡(P值均大于0.05).
　　2.我們發(fā)現(xiàn)miR-146ars2910164與AS存在相關性。AS組G等位基因頻率(49.0％ vs.35.2％,P=0.005, Pc=0.01, OR=1.767,95％CI=I.191～2.621)和GG基因型頻率(24.5％ vs.11.4％，P=0.014，Pc=0.042，OR=2.516，95％CI=1.187～5.336)明顯高于健康對照組。
　　3.mi

10、R-146a rs57095329、rs6864584、rs2431697、rs2277920 SNPs各基因型頻率和等位基因頻率在AS患者和健康對照組間不存在顯著性差異(P值均大于0.05)。
　　4.miR-499 rs3746444 T/C SNP等位基因頻率（P=0.369，power=15％）和基因型頻率(Pc＞0.05，power=37％)在AS患者和健康對照組之間也不存在顯著性差異。
　　5.基因連鎖分析發(fā)現(xiàn)m

11、iR-146a rs57095329和rs2277920存在較強的連鎖關系(D'=0.904，r2=0.708);miR-146a5種SNPs共構(gòu)建了19種單體型，其中CATTT單體型(rs2910164/rs57095329/rs6864584/rs2431697/rs2277920)在AS患者中的頻率明顯低于健康對照組(39.9％ vs53.6％，x2=6.576，P=0.01，OR=0.574，95％CI=0.375～0.879)

12、;而GGTTC單體型(rs2910164/rs57095329/rs6864584/rs2431697/rs2277920)頻率在AS組明顯高于健康對照(27.7％ vs14.9％，x2=8.792，P=0.003，OR=2.192,95％CI=1.296～3.707)。
　　6.miR-146a SNPs各基因型的AS患者外周血中CRP和ESR水平不存在顯著性差異。AS患者外周血中CRP和ESR水平在miR-499各基因型之間也

13、不存在顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　我們首次證實了miR-146a G等位基因和GG基因型是AS的危險因素。該SNP可能可以作為AS鑒定的候選指標。miR-146a rs57095329、rs6864584、rs2431697、rs2277920和miR-499 rs3746444可能與AS不存在相關性，但還需要大樣本實驗進一步驗證。GGTTC單體型可能是AS的危險因素，而CATTT單體型可能是一個保護性因素。另外，這兩個m