降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對大鼠非酒精性脂肪肝形成的影響及相關機制研究.pdf

1、隨著肥胖、高脂血癥、2型糖尿病和代謝綜合征等疾病在全世界范圍的流行，非酒精性脂肪性肝（NAFLD）的發(fā)病率也不斷上升。近期研究表明，經(jīng)過4~13年后大約50％的NAFLD患者發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎（NASH），40%的發(fā)展為肝纖維化。NAFLD的病理生理過程極為復雜，其發(fā)病機制仍不明確，并且目前沒有有效的治療方法，NASH的預后也不容樂觀。因此，非常有必要對非酒精性脂肪肝患者制定有效的干預措施。
　　NAFLD患者常伴有肥胖、胰島

2、素抵抗，但并不是所有的肥胖者都可以發(fā)展為NAFLD，腸道因素在NAFLD的致病機制中發(fā)揮了很大作用。研究顯示，腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素（LPS），它們經(jīng)門靜脈輸送到肝臟，當腸道菌群失衡時，大量的革蘭氏陰性菌增殖并產(chǎn)生內(nèi)毒素，就會導致患者發(fā)生代謝紊亂，肥胖，糖尿病，NAFLD以及NASH。在對急性肝損傷小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸粘膜通透性增強和細菌移位，并出現(xiàn)腸道菌群的改變。此外，在對NAFLD患者以及動物模型的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，

3、其循環(huán)內(nèi)毒素水平都明顯高于正常水平，還存在著小腸細菌過度生長，腸粘膜通透性增加的現(xiàn)象。由于腸道菌群和肥胖、胰島素抵抗、NAFLD密切相關，所以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構有可能起到防治NAFLD的作用。
　　益生菌和中藥均可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善NAFLD。已經(jīng)有研究顯示，益生菌具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和降低機體膽固醇水平的作用，許多益生菌被制作成酸奶供高脂血癥和NAFLD患者食用。此外，決明子作為一種具有抑制脂肪積累的天然功能性食品添加劑

4、，在改善肥胖,胰島素抵抗等代謝疾病中取得了良好的效果，這為NAFLD的治療提供了新的方向。決明子是豆科一年生草本植物，廣泛種植于熱帶亞洲國家，其主要有效成分為蒽醌類化合物，包括：決明素、大黃素、蘆薈大黃素等。它的草本成分被作為一種功能性飲料在該地區(qū)流行，并且具有降血脂，降膽固醇，抗氧化，抗真菌，保護神經(jīng)功能等生理效應。決明子不僅對急性肝損傷大鼠肝功能有保護作用，而且可以通過上調(diào)AMP依賴的蛋白激酶，從而改善肥胖、胰島素抵抗以及NAFLD

5、。
　　雖然，益生菌和決明子均具有改善肥胖、胰島素抵抗、NAFLD等代謝疾病的效果，但是益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌是否可以提高NAFLD的防治效果仍不明確。綜上所述，我們假設益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌可以更好的改善NAFLD，其機制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構以及肝臟的能量代謝有關。為了驗證上述假設，我們擬通過體外篩選和鑒定具有明確降脂效果的益生菌菌株，并與決明子蒽醌進行聯(lián)合培養(yǎng)，驗證其降脂效率的變化。再將篩選出的降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對高

6、脂飲食誘導的NAFLD大鼠進行干預，并驗證干預效果。
　　第一部分降脂益生菌的體外篩選及生物學特性研究
　　目的：
　　前期我們使用硫酸鐵銨法，從健康人體以及傳統(tǒng)發(fā)酵食物中，篩選出了具有高效降膽固醇的菌株（體外降膽固醇效率>50%）。在此基礎上，我們進一步評估其降甘油三酯的能力，以及耐酸、耐膽鹽、耐胃蛋白酶、耐胰蛋白酶、細胞黏附性等生物學特性，并聯(lián)合決明子總蒽醌共培養(yǎng)，了解其降脂效率的變化，選出最優(yōu)菌株為下一步實驗打下

7、基礎。
　　材料與方法：
　　1.降膽固醇菌株與決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)，在MRS膽固醇培養(yǎng)基中，使用硫酸鐵銨法對其降膽固醇效率進行檢測，并比較前后降膽固醇效率的變化。
　　2.在MRS甘油三酯培養(yǎng)基中，對降膽固醇菌株以及其和決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)的降脂效率進行檢測，并比較降甘油三酯效率的變化。
　　3.對菌株進行耐受胃酸、耐受膽鹽、耐受胃蛋白酶、耐受胰蛋白酶、細胞黏附性實驗，評估其生物學特性。
　　4.將篩選出

8、的最優(yōu)菌株進行質(zhì)粒檢測，并提取DNA進行菌種鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.降膽固醇菌株聯(lián)合決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)后，降膽固醇效率均有所提升，其中以DM9054、DM9073、86066前后降解效率提高最為顯著(P<0.05)。
　　2.降膽固醇菌株聯(lián)合決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)后，菌株8503、84034、86066降甘油三酯提高最為顯著(P<0.05)。
　　3.菌株DM9054和86066具有較好的耐胃酸能力，菌株DM

9、9007、DM9054、86066有較好的耐膽鹽能力，DM9054和86066有較好的胃蛋白酶耐受能力，各個菌株對胰蛋白酶均有很好耐受力；相對于其他菌株，菌株DM9007、DM9054、86066細胞黏附性最強(P<0.05)。
　　4.最優(yōu)菌株為 DM9054、86066，檢測無質(zhì)粒存在，經(jīng)過16SrDNA測序比對，DM9054為鼠李糖乳桿菌、86066為植物乳桿菌。
　　結(jié)論：
　　DM9054為鼠李糖乳桿菌、86

10、066為植物乳桿菌，均為益生菌，并且其聯(lián)合決明子總蒽醌培養(yǎng)可以提高降解膽固醇和甘油三酯的效率，起到協(xié)同作用。同時，菌株具有較好的耐受消化液以及對腸上皮細胞的黏附能力，并不帶有質(zhì)粒。
　　第二部分降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及相關基因表達的影響
　　目的：
　　通過篩選出的降脂益生菌 DM9054、86066，并聯(lián)合具有協(xié)同降脂作用的決明子總蒽醌，共同干預NAFLD大鼠，分析其對脂代謝過程中相關基

11、因和蛋白表達情況，以期發(fā)現(xiàn)降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌可能在脂代謝通路中的作用靶點，進一步探討其改善NAFLD的機制。
　　材料與方法：
　　1. SD大鼠隨機分為5組，分別給予正常飲食（ND），高脂飲食（HFD），高脂飲食+決明子總蒽醌0.2g/kg（HFD+AC），高脂飲食+高效降膽固醇益生菌2×1010 CFU/mL（HFD+P），高脂飲食+決明子總蒽醌+益生菌（HFD+TAC+P），所有分組大鼠連續(xù)干預150天后處死。

12、
　　2.評估各組大鼠一般情況，以及體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)變化。
　　3.檢測各組大鼠血脂水平、胰島素抵抗情況，評估血清內(nèi)毒素和肝臟TNF-α水平，并通過HE和油紅O染色觀察各組大鼠肝臟病理學改變。
　　4.檢測大鼠肝臟 CYP7A1、HMGCR、LDLR mRNA表達水平，以及腸道FXR mRNA表達水平，Western-Bloting檢測肝臟PPAR-α、PPAR-γ、SREBP-1c蛋白表達水平。
　

13、　結(jié)果：
　　1.連續(xù)150天高脂飲食誘導，成功建立了非酒精性脂肪肝大鼠模型。
　　2.各組大鼠生命體征平穩(wěn)，高脂飲食組大鼠體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)較其余各組顯著增加(P<0.05)，通過降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應用，均可以顯著降低大鼠體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)(P<0.05)。
　　3.高脂飲食組大鼠TC、TG、LDL、FFA、胰島素抵抗狀態(tài)、血清內(nèi)毒素以及肝臟TNF-α水平，較其余各組均顯著升高(P

14、<0.05)，而HDL則顯著降低（P<0.05），并且肝臟HE和油紅O染色可見明顯脂肪變性以及炎細胞浸潤。使用降脂益生菌、決明子總蒽醌以及聯(lián)合應用干預后，均顯著降低了 TC、TG、LDL、FFA，胰島素抵抗狀態(tài)、血清內(nèi)毒素以及肝臟TNF-α水平，并升高了HDL(P<0.05)，肝臟病理觀察，不同程度改善了肝臟脂肪變性以及炎細胞浸潤程度。
　　4.與高脂飲食組相比，通過降脂益生菌、決明子總蒽醌以及二者聯(lián)合應用的干預，顯著上調(diào)了肝臟

15、CYP7A1、LDLR mRNA，PPAR-α蛋白和腸道 FXR mRNA的表達，并下調(diào)肝臟中HMGCR mRNA以及SREBP-1c、PPAR-γ蛋白的表達(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　降脂益生菌和決明子總蒽醌可以通過調(diào)節(jié)大鼠血脂水平，以及脂代謝相關基因的表達，改善高脂飲食誘導的NAFLD大鼠，而且二者聯(lián)合應用效果最為顯著。其具體機制可能是：通過上調(diào)肝臟中CYP7A1、LDLR mRNA，以及腸道FXR mRNA的表

16、達，并抑制SREBP-1c的生成，促進膽固醇吸收和排泄。并下調(diào)肝臟中HMGCR mRNA的表達，減少膽固醇合成。同時促進肝臟中PPAR-α的表達，抑制PPAR-γ的表達，促進膽固醇代謝，減少其外流的作用。從而調(diào)節(jié)了大鼠血脂代謝水平，改善了胰島素抵抗狀態(tài)，并降低了肝臟炎癥因子和腸源性內(nèi)毒素的釋放。
　　第三部分降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群結(jié)構及腸黏膜屏障功能的影響
　　目的：
　　腸道菌群結(jié)構和

17、腸黏膜屏障功能在NAFLD發(fā)病過程中起重要作用。因此，在第二部分研究的基礎上，進一步探討降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應用，通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構和腸黏膜屏障完整性改善NAFLD的作用機制。
　　材料與方法：
　　1.通過糞便 DNA提取試劑盒提取各組大鼠糞便樣本 DNA，并對DNA質(zhì)量進行檢測，進一步對V4區(qū)進行擴增，瓊脂糖電泳檢測擴增效果。
　　2.通過Illumina Miseq平臺對大鼠腸道50、100、15

18、0天樣本進行測序，并對序列進行修剪和分類，獲取優(yōu)質(zhì)序列進行分析。
　　3.根據(jù)測序結(jié)果，對各組大鼠腸道菌群組成、物種豐度差異以及各組腸道菌群結(jié)構的組間相似性進行分析。
　　4.病理切片觀察各組大鼠腸黏膜情況，Western-Blotting檢測腸黏膜緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.對各組大鼠糞便樣本提取總DNA質(zhì)量檢測，OD260/OD280總體值均在1.8~2.0之間，并

19、使用V4區(qū)引物，成功擴增出條帶。
　　2.通過Illumina Miseq高通量測序共得到7,583,846條序列信息，經(jīng)過修剪和篩選獲得5,740,971條優(yōu)質(zhì)序列，優(yōu)質(zhì)序列比例為75.7%，平均每個樣本63,788條，序列長度均在225~226bp之間。并且從序列的稀釋曲線可以看出足夠覆蓋腸道微生物中97%以上的菌種，且豐度分布均勻。
　　3.對各組大鼠腸道菌群組成分析發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組腸道厚壁菌門比例增加顯著，并且擬桿菌

20、門比例顯著減少。在分析大鼠腸道微生物屬水平時，我們發(fā)現(xiàn)與正常飲食組相比，高脂飲食大鼠腸道擬桿菌屬、乳酸菌屬、變性菌屬豐度均顯著降低，而顫螺旋菌屬豐度卻顯著升高（P<0.05）。通過降脂益生菌和決明子總蒽醌干預，升高了擬桿菌屬、乳酸菌屬、變性菌屬豐度，并降低了顫螺旋菌屬豐度（P<0.05）。降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌效果最為顯著。對各組大鼠腸道微生物的組成以及相似性，進行了PCoA分析和聚類分析。結(jié)果顯示通過降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌干預

21、的大鼠，腸道菌群結(jié)構最接近于正常。熱圖的聚類分析也進一步證實了此結(jié)果。
　　4.病理觀察發(fā)現(xiàn)高脂飲食組大鼠小腸絨毛出現(xiàn)斷裂，缺失，間隙增寬，上皮細胞壞死、脫落的現(xiàn)象；并且腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達量較其它各組顯著降低（P<0.05）。而通過降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應用干預后，各干預組絨毛排列較為整齊，缺失斷裂減少，形態(tài)有所恢復；還增加了腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達量（P<0.05