TC1(C8orf4)在肺癌中的表達(dá)和意義研究.pdf

1、目的：
　　TC1(thyroid cancer-1)是近年發(fā)現(xiàn)的由C8orf4基因編碼的核蛋白，它首先被發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)，研究證實(shí)，TC1蛋白之所以可以影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，是因?yàn)樵谒腃OOH端，有三個(gè)緊密螺旋的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可以保證其與相應(yīng)的目的蛋白結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。另有研究證實(shí)，TC1作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路上游調(diào)節(jié)基因與β-catenin競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cby(Chibby)，減輕cby對(duì)

2、下游靶基因-如cyclin D1，MMP-7，MMP-14，CD44，c-Met等的抑制作用，從而間接的增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　但是，肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等三大惡性生物學(xué)行為和TC1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況的關(guān)系目前還不明確。為了探究上述問(wèn)題，本文對(duì)肺癌中的TC1表達(dá)情況做了檢測(cè)，研究并分析TC1表達(dá)和臨床病理的關(guān)系，并進(jìn)一步探討了TC1的甲基化水平，TC1與β-cat

3、enin表達(dá)的相關(guān)性。
　　方法：
　　一、組織標(biāo)本來(lái)源
　　在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。91例肺癌組織來(lái)自2008-2010年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)的病人，組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。患者術(shù)前均未接受放化療，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)判定其組織學(xué)診斷和分化程度。術(shù)后隨訪上述91例患者。
　　二、細(xì)胞系來(lái)源
　　人肺癌細(xì)胞系H1299、A549

4、、LK2、LTE均源于ATCC(American Type Culture Collection)，細(xì)胞均培養(yǎng)于含10％胎牛血清、青霉素(0.1 mg/ml)、鏈霉素(0.1mg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃含5％ CO2的培養(yǎng)箱，按時(shí)換液及傳代。
　　三、免疫組織化學(xué)染色
　　組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。將石蠟包埋的肺癌組織塊切成4μm厚切片。以PBS代替—抗作為空白對(duì)照。使用即用SP超敏免疫組

5、化試劑盒（邁新，福州，中國(guó)），兔抗人TC1(1∶200)。兩位病理醫(yī)生對(duì)切片分別作出判定，每張組織切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，陽(yáng)性率根據(jù)陽(yáng)性癌細(xì)胞所占百分比計(jì)算。TC1表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，也可在細(xì)胞核中表達(dá)。每個(gè)病例的TC1的陽(yáng)性率1％-25％為1分、＞25％-50％為2分、＞50％-75％為3分、＞75％-100％為4分，染色強(qiáng)度分為0分（無(wú)著色）、1分（黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）。陽(yáng)

6、性率與強(qiáng)度評(píng)分相乘:≤6分為低表達(dá)，≥8分為高表達(dá)。當(dāng)＞10％的癌細(xì)胞胞核染色陽(yáng)性時(shí)則該病例定義為核表達(dá)陽(yáng)性。
　　四、DNA提取與亞硫酸鹽處理后測(cè)序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)
　　按照北京白太克公司的組織/細(xì)胞DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA。準(zhǔn)確定量后，按照EZ DNA甲基化試劑盒(ZYMO)說(shuō)明書進(jìn)行DNA樣品甲基化修飾處理，獲得DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR及測(cè)序。
　　五、RT-PCR

7、檢測(cè)
　　利用總RNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書提取基因組RNA，建立PCR反應(yīng)體系。將產(chǎn)物純化后，采用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
　　六、Western blot檢測(cè)
　　依次經(jīng)過(guò)樣本總蛋白的提取定量、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、底物發(fā)光實(shí)驗(yàn)后，最后用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。
　　七、統(tǒng)計(jì)分析
　　各組資料利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

8、P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、肺癌組織中TC1表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系。
　　在肺癌組織中，TC1表達(dá)與肺癌的TNM分期(P=0.005)、分化程度(P＜0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.023)顯著相關(guān)。
　　2、肺癌組織中TC1表達(dá)水平與肺癌生存概率的關(guān)系。
　　TC1低表達(dá)組肺癌患者生存率值明顯高于TC1高表達(dá)組(P＜0.05)。
　　3、肺癌細(xì)胞中存在TC1基因啟動(dòng)子甲基

9、化狀態(tài)。
　　在肺癌細(xì)胞中，44、81、94、105bp位點(diǎn)均為甲基化狀態(tài)。
　　4、肺癌細(xì)胞中TC1與β-catenin的表達(dá)相關(guān)性。
　　TC1與β-catenin表達(dá)具有協(xié)同現(xiàn)象，rs，分別為0.790、0.589，P值(sig)均＜0.05，二者的表達(dá)在肺癌組織中高度正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、TC1的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　2、TC1高表達(dá)與肺癌患者的