腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎炎癥-腫瘤序列演進(jìn)中的作用研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型腹腔注射腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（EGC）培養(yǎng)上清液進(jìn)行干預(yù)，以及將EGC與小鼠腸上皮細(xì)胞(IEC-6)共培養(yǎng)，從體內(nèi)體外兩方面探討EGC在潰瘍性結(jié)腸炎炎癥-腫瘤序列演進(jìn)中的作用及可能機(jī)制。
　　方法：⑴采用隨機(jī)數(shù)字表法將180只SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組，即：A實(shí)驗(yàn)組（EGC+DSS），B條件對(duì)照組(DMEM+DSS)，C模型組（DSS）和D空白對(duì)照組（Contro

2、l）。前三組給予AOM及2％DSS干預(yù)，構(gòu)建結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型，定時(shí)觀察記錄各組小鼠的一般情況，并進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分。實(shí)驗(yàn)組從第4周開(kāi)始每天腹腔注射EGC培養(yǎng)上清液100uL干預(yù)。各組分別在實(shí)驗(yàn)第1、3、4、6、7、9、12、15及20周末采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取5只小鼠采集外周血后處死小鼠，收集腸組織標(biāo)本。外周血離心后收集血清標(biāo)本采用抗體芯片檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子水平，ELISA法檢測(cè)NGF、GDNF細(xì)胞因子水平；腸組

3、織標(biāo)本測(cè)量長(zhǎng)度并進(jìn)行結(jié)腸大體損傷程度(CMDI)評(píng)分，HE染色并進(jìn)行組織損傷程度(HS)評(píng)分，觀察從潰瘍性結(jié)腸炎炎癥-不典型增生-腫瘤演進(jìn)過(guò)程中的病理變化并統(tǒng)計(jì)成瘤率和瘤體數(shù)目（≥2mm）。免疫組化法檢測(cè) GFAP、S100β及PGP9.5等蛋白的表達(dá)，Western Blot法檢測(cè)腸組織NF-κB、IKKβ、PI3K、AKT、PTEN及ZO-1等蛋白的表達(dá)。⑵利用Transwell小室共培養(yǎng)EGC和IEC-6細(xì)胞，在共培養(yǎng)系統(tǒng)加入TN

4、F-a和IL-6細(xì)胞因子（30ug/ml）進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)熒光素滲漏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGC對(duì)IEC-6單層細(xì)胞屏障功能的影響，BrdU摻入法檢測(cè)EGC對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGC對(duì)IEC-6細(xì)胞周期及凋亡的影響，Western Blot法檢測(cè)EGC對(duì)IEC-6細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、E-Cadherin及ZO-1等蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：①DAI評(píng)分：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型組DAI評(píng)分1W（0.67±0.

5、62 vs0）、4W（0.80±0.73 vs0）、7W（1.00±0.85 vs0）、9W（0.67±0.47vs0.07±0.15）、12W（0.93±0.43 vs0.20±0.18）、15W（1.13±0.18 vs0.20±0.45）及20W（1.53±0.30vs0.07±0.15）均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與條件對(duì)照組對(duì)比各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②CMDI評(píng)分：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型組CMDI評(píng)分

6、1W（0.56±0.47vs0）、4W（2.37±1.57vs0）、7W（3.56±1.65vs0）、9W（2.86±0.99vs0）、12W（2.02±1.24 vs0）、15W（3.26±1.13 vs0）及20W（3.88±0.90vs0）均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與條件對(duì)照組對(duì)比7W（1.32±1.38vs3.96±1.49，p＜0.01）,20W（2.63±0.64 vs3.83±0.80，p＜0.05）

7、減低，其余各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③HS評(píng)分：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型組HS評(píng)分各時(shí)間點(diǎn)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與條件對(duì)照組對(duì)比4W（8.84±1.10 vs10.66±1.25。p＜0.05）,7W（10.32±1.58 vs13.96±2.49，p＜0.05）減低，其余各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④結(jié)直腸長(zhǎng)度：與正常對(duì)照組對(duì)比，模型組除3W（8.82±0.95 vs9.56±0.66。p＞0.05）外其余時(shí)

8、間點(diǎn)結(jié)直腸長(zhǎng)度均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組與條件對(duì)照組對(duì)比各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤成瘤率及瘤體數(shù)目（≥2mm）:實(shí)驗(yàn)組、條件對(duì)照組和模型組均從第6周末開(kāi)始出現(xiàn)重度不典型增生及癌變，第6W成瘤率為50%，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，至第20W均達(dá)100%。第15W腫瘤數(shù)目（≥2mm）實(shí)驗(yàn)組vs條件對(duì)照組：3.17±1.72 vs5.83±2.04，p＜0.05；第20W腫瘤數(shù)目（≥2mm）實(shí)驗(yàn)組vs條件對(duì)照組：2.6

9、7±1.37vs5.67±2.58，p＜0.05。其余時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑥抗體芯片結(jié)果顯示：第4W開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組血清細(xì)胞因子TIMP-1（A/B由4W5.99倍降至20W0.00倍），M-CSF（A/B由4W3.48倍降至20W0.42倍），G-CSF（A/B由4W3.48倍降至20W0.39倍），IL-6（A/B由4W2.60倍降至20W0.44倍）逐漸降低。而MIP-1a（A/B由4W1.00倍升高至20W67.32倍），IL-2

10、（A/B由4W078倍升高至20W3.67倍），BLC（A/B由4W1.30倍升高至20W2.95倍）逐漸升高。⒄ELISA法檢測(cè)GDNF和NGF結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組NGF在第4、9、15及20周較條件對(duì)照組升高（p＜0.05），GDNF從第6周開(kāi)始較條件對(duì)照組均升高（p＜0.05）。⑧Western Blot結(jié)果顯示：4W和6W實(shí)驗(yàn)組vs條件對(duì)照組ZO-1表達(dá)升高（p＜0.05）。其余時(shí)間點(diǎn)各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑨熒光素滲漏試驗(yàn)結(jié)果：

11、IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6（724.33±22.08 vs1451.50±36.18，p＜0.01），IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a（1261.17±53.08 vs2623.50±62.77，p＜0.01）下室熒光素量均減少。⑩Western Blot結(jié)果顯示：IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6 ZO-1和E-cadherin表達(dá)升高（p<0.01），而

12、IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a ZO-1和E-cadherin表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a Bcl-2表達(dá)升高（p<0.05），而在共培養(yǎng)體系加入IL-6 Bcl-2表達(dá)無(wú)差異。
　　結(jié)論：⑴成功構(gòu)建AOM/DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。⑵在結(jié)腸炎炎癥-腫瘤序列演進(jìn)過(guò)程中，EGC可降低血清炎癥細(xì)胞因子水平，升高血清NGF、GDNF水平