Rab11蛋白在合體滋養(yǎng)細(xì)胞外體過度分泌中作用的研究.pdf

1、目的:
　　子癇前期（preeclampsia-PE）是指妊娠20周后出現(xiàn)的高血壓和蛋白尿。若無蛋白尿癥狀時(shí)，PE診斷為高血壓合并血小板減少、肝酶升高、腎功能不全、肺水腫、視覺障礙以及頭痛神經(jīng)系統(tǒng)障礙等全身各個(gè)系統(tǒng)的疾病。PE影響著3％-10％的妊娠婦女，是母體和胎兒發(fā)病率和死亡率的首要原因。PE發(fā)展為子癇，引起抽搐，在產(chǎn)婦中大約有2.7-8.2/10000會(huì)發(fā)展為子癇。PE可合并腦出血、肝臟破裂、肺水腫、急慢性腎衰、早產(chǎn)、胎兒宮

2、內(nèi)生長(zhǎng)受限、死胎、死產(chǎn)以及孕產(chǎn)婦的死亡等。終止妊娠是PE唯一有效的治療方法，產(chǎn)后胎盤娩出后患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)，說明胎盤是PE發(fā)生、發(fā)展的主要因素。
　　胚胎植入后，胎盤形成的過程與子宮內(nèi)膜微環(huán)境相關(guān)。早期妊娠時(shí)胎盤是在一個(gè)相對(duì)低氧的環(huán)境下形成的，胎盤形成過程，也是氧濃度變化的一個(gè)過程，在胚胎著床時(shí)，宮腔內(nèi)的氧含量為3％，而蛻膜和子宮肌層內(nèi)的氧含量為8％-12％。這個(gè)氧濃度梯度促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)層入侵子宮肌層、蛻膜以及螺旋動(dòng)脈的重塑。滋養(yǎng)

3、層錨定母體組織，并入侵螺旋動(dòng)脈內(nèi)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞相互作用，改變螺旋動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)。早孕末期，螺旋動(dòng)脈管腔內(nèi)阻塞的滋養(yǎng)層細(xì)胞減少直至消失，低阻力、高流量的螺旋動(dòng)脈形成，母體血液灌注至胎盤絨毛間隙，母胎界面形成。螺旋動(dòng)脈重塑后胎盤內(nèi)的氧濃度升高至正常范圍。有缺陷的滋養(yǎng)層的入侵和子宮螺旋動(dòng)脈的重塑障礙引起胎盤的血管收縮和反應(yīng)性，進(jìn)而引起缺氧和活性氧的產(chǎn)生，激活低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，

4、HIF-1α)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。當(dāng)胎盤缺血、缺氧時(shí)，子宮胎盤血供減少，灌注不足，胎盤絨毛狀結(jié)構(gòu)被破壞，合成和釋放大量血管活性因素，以及促炎性細(xì)胞因子、內(nèi)皮素、合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡等胎盤源性不良因子，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，最終引起妊娠20周后高血壓、蛋白尿等PE臨床癥狀的發(fā)生。目前研究廣泛認(rèn)為胎盤源性不良因子的釋放是PE發(fā)生、發(fā)展的中心通路。
　　合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞外體(syncytiotrophoblast exosome，

5、STBEX)是合體滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的胎盤源性不良因子的一種，屬于細(xì)胞間連接物質(zhì)，是一種納米級(jí)囊泡。在正常妊娠時(shí)，STBEX作為細(xì)胞間連接分子，在絨毛外滋養(yǎng)層和血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，在螺旋動(dòng)脈的重塑過程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，STBEX在胎盤和外周血免疫細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)母體對(duì)胎兒的免疫耐受，在母胎界面血管的形成和成功妊娠中發(fā)揮著重要的作用。STBEX最早在妊娠第六周時(shí)出現(xiàn)于循環(huán)血液中，且隨著孕周的增加，STBEX

6、的水平明顯升高。但在PE等病理妊娠中，STBEX的作用尚未完全闡明。與同孕周的正常妊娠患者相比，PE患者STBEX的水平明顯升高。此外研究發(fā)現(xiàn)，STBEX可以激活單核細(xì)胞，使其分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，造成類似PE嚴(yán)重的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。STBEX還可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖而促進(jìn)免疫反應(yīng)。STBEX表面的HLA-G5、B7-H1和B7-H3等免疫分了可以激活抗原提呈細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡。STB

7、EX可通過多種途徑作用于母體，既可以引起導(dǎo)致局部的炎性反應(yīng)又可以調(diào)節(jié)全身的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是母體炎癥因子和免疫平衡兩方面的重要調(diào)控因素，在PE的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　Rab蛋白是GTP酶Ras超家族中最大的分支，在包括真核細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著十分重要的作用。Rab11表達(dá)在胎盤組織中，但是其在胎盤中的作用尚未見明確報(bào)道。本文旨在探討PE中，缺氧時(shí)Rab11對(duì)STBEX過度分泌機(jī)制作用

8、研究，以及Rab11蛋白在正常妊娠和PE患者胎盤組織中表達(dá)的差異。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.用福司可林(Forskolin)融合Bewo細(xì)胞，模擬胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞。
　　2.分別在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)融合Bewo細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，根據(jù)是否融合與培養(yǎng)條件的不同，將細(xì)胞分為四組。①BeWo常氧組:BeWo細(xì)胞在普通培養(yǎng)基、常氧條件下培養(yǎng);②BeWo低氧組:Bewo細(xì)胞在普通培養(yǎng)基、低氧條件下培養(yǎng)(92％

9、N2、5％CO2，3％O2);③融合BeWo常氧組:BeWo細(xì)胞以Forskolin誘導(dǎo)48h后，常氧條件下培養(yǎng);④融合BeWo低氧組:BeWo細(xì)胞以Forskolin誘導(dǎo)48h后，低氧條件下培養(yǎng)(92％ N2、5％CO2，3％O2)。
　　3.BCA法檢測(cè)各組上清液中STBEX蛋白濃度。
　　4.Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-1α、Rab11蛋白的表達(dá)量。
　　5.用RNA干擾技術(shù)沉默HIF-1α后，

10、檢測(cè)各組細(xì)胞Rab11蛋白的表達(dá)變化。
　　第二部分:
　　1.搜集重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院產(chǎn)科2014年10月-2015年10月住院產(chǎn)婦，選取子癇前期(PE)患者12例作為實(shí)驗(yàn)組，正常晚孕產(chǎn)婦12例作為對(duì)照組，收集剖宮產(chǎn)后的胎盤組織。
　　2.分別在常氧條件下和缺氧條件下培養(yǎng)PE胎盤絨毛組織和正常妊娠患者胎盤絨毛組織。分為PE常氧組、PE缺氧組、正常(N)常氧組、正常(N)缺氧組四組。提取各組培養(yǎng)上清液中的STBE

11、X及其蛋白組織，BCA法檢測(cè)STBEX蛋白濃度。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)各組上清液中HIF-1α濃度。
　　4.Western-blot檢測(cè)正常妊娠和PE患者胎盤組織中HIF-1α、Rab11蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與Bewo常氧組比較，Bewo低氧組上清液中STBEX蛋白濃度升高，差異顯著(p＜0.05);與融合Bewo常氧組比較，融合Bewo低氧組上清液中STBEX的蛋白濃度升高

12、，差異顯著(p＜0.05);
　　2.融合Bewo低氧組中HIF-1α、Rab11蛋白表達(dá)水平顯著高于融合Bewo常氧組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05; Bewo低氧組中HIF-1α、Rab11蛋白表達(dá)水平顯著高于Bewo常氧組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。
　　3.siRNA干擾，沉默融合細(xì)胞HIF-1α后，細(xì)胞內(nèi)的Rab11蛋白表達(dá)降低。
　　4.分別將PE、正常妊娠胎盤絨毛組織在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)后，

13、檢測(cè)上清液中STBEX蛋白濃度和HIF-1α的水平。與PE常氧組相比，PE缺氧組STBEX蛋白濃度與HIF-1α水平升高，差異顯著，p＜0.05;與正常缺氧組相比，PE缺氧組中STBEX蛋白濃度與HIF-1α水平升高，差異顯著，p＜0.05;與正常常氧組相比，PE常氧組中STBEX蛋白濃度與HIF-1α水平升高，差異顯著，p＜0.05。
　　5.HIF-1α與Rab11蛋白表達(dá)在正常妊娠胎盤組織與PE胎盤組織中，與正常胎盤組織相比

14、，PE胎盤組織中HIF-1α、Rab11蛋白的表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。
　　結(jié)論:
　　1.低氧條件下，PE胎盤組織中Rab11蛋白表達(dá)量明顯升高，使STBEX及胎盤囊泡釋放增加，可能與PE患者胎盤淺著床有關(guān)。
　　2.低氧環(huán)境下，融合Bewo細(xì)胞中HIF-1α、Rab11蛋白的表達(dá)量升高，用RNA干擾技術(shù)沉默融合細(xì)胞內(nèi)HIF-1α后，細(xì)胞內(nèi)的Rab11蛋白表達(dá)降低。說明HIF-1α可能通過調(diào)控R