SCIN促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲機(jī)制及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 SCIN促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲機(jī)制研究
　　目的:
　　胃癌在全世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率排在所有腫瘤的第四位，而死亡率則位居所有腫瘤相關(guān)死亡原因的第二位。盡管由于近年來手術(shù)技術(shù)的發(fā)展、放化療的應(yīng)用以及早期診斷的增多，胃癌的死亡率有所下降，但是進(jìn)展期胃癌患者的生存率仍然很低。許多胃癌患者在經(jīng)過根治手術(shù)以及化療后，仍然會有復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而在胃癌發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后，其治療更加困難，手術(shù)難度加大

2、。而胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是目前對其治療的最大難關(guān)，目前對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制仍然不甚明了，故闡明胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制對胃癌的治療意義重大。
　　課題組前期研究已經(jīng)表明，SCIN在胃癌組織中存在表達(dá)，且表達(dá)明顯高于癌旁組織，SCIN的表達(dá)與患者預(yù)后存在明顯相關(guān)性，SCIN高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)者，SCIN還具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和成瘤的能力，但是其中的具體分子機(jī)制和通路仍然未知。
　　本研究旨在闡明

3、SCIN促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的具體機(jī)制，并探討SCIN作為胃癌預(yù)后指標(biāo)及成為治療靶點(diǎn)的可能性。
　　方法:
　　1.通過免疫熒光染色的方法來觀察在敲低SCIN后，胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422的偽足形成能力的變化情況。
　　2.通過qRT-PCR檢測敲低SCIN后胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中Cdc42分子RNA表達(dá)的改變。
　　3.通過Western blotting

4、檢測在敲低SCIN后，胃癌細(xì)胞系MGC803和胃癌原代細(xì)胞XN0422中Cdc42分子蛋白表達(dá)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中敲低SCIN后，兩種細(xì)胞均能觀察到敲低組細(xì)胞的偽足數(shù)量較對照組明顯減少。
　　2.通過qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中敲低SCIN后，兩種細(xì)胞的敲低組Cdc42的RNA表達(dá)減少，且較對照組減少

5、約50％。
　　3.通過Western blotting檢測胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中敲低SCIN后，兩種細(xì)胞的敲低組Cdc42的蛋白表達(dá)均較對照組減少，而蛋白表達(dá)減少量較RNA表達(dá)減少量更加明顯。
　　結(jié)論:
　　1.偽足形成能力的改變參與了SCIN促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。
　　2.敲低SCIN可以降低胃癌細(xì)胞中Cdc42的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量，說明SCIN對偽足形成的調(diào)控作用是通過

6、對Cdc42的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)。
　　第二部分 胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立及特性鑒定
　　目的:
　　胃腸道間質(zhì)瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，起源于胃腸道間質(zhì)的Cajar細(xì)胞，其發(fā)病率約為每年10～20/10萬。胃腸道間質(zhì)瘤主要發(fā)生于胃(50％～70％)，其次為小腸(20％～30％)，其他發(fā)病部位可包括食管，結(jié)直腸甚至消化道外的其他部位（小于10％）。

7、目前原發(fā)性胃腸道間質(zhì)瘤的主要治療方法是手術(shù)切除并配合術(shù)后伊馬替尼進(jìn)行靶向治療。
　　c-kit基因(75％-85％)或者PDGFRA基因(platelet-derived growth factor receptoralpha;5％-7％)發(fā)生功能獲得性突變是大多數(shù)胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)病的始動因素，進(jìn)而使酪氨酸激酶持續(xù)激活，并獲得不受機(jī)體調(diào)控的增殖能力。因此胃腸道間質(zhì)瘤是可以通過酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼類藥物進(jìn)行治療的。然而伊馬替尼也無

8、法治愈此病，耐藥后的復(fù)發(fā)是最主要因素，有多達(dá)50％的患者會發(fā)生耐藥進(jìn)而腫瘤復(fù)發(fā)，而發(fā)生耐藥及復(fù)發(fā)的時(shí)間往往在中位治療期2年內(nèi)。
　　盡管目前對伊馬替尼耐藥的部分機(jī)制有所了解，但是對其深層的分子機(jī)制仍然知之甚少。而當(dāng)前對胃腸道間質(zhì)瘤的研究因?yàn)槿狈线m的及容易獲取的細(xì)胞系而受到限制。據(jù)我們所知，目前有公開報(bào)道的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系并不多，僅包括GIST-T1、GIST-H1以及GK1C和GK3C。
　　研究旨在建立一株胃腸道間質(zhì)瘤

9、細(xì)胞系，并對其進(jìn)行相對完整的特性鑒定以使其可以廣泛應(yīng)用于胃腸道間質(zhì)瘤的研究。
　　方法:
　　1.通過組織塊法對腫瘤組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，在腫瘤細(xì)胞爬出后通過局部傳代的方式富集腫瘤細(xì)胞，而后通過凍存、復(fù)蘇和傳代以淘汰成纖維細(xì)胞并獲得穩(wěn)定的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系。
　　2.通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測患者腫瘤組織以及移植瘤中的CD117，CD34，DOG-1，α-SMA，S-100的表達(dá)。
　　3.通過免疫熒光染色的

10、方法檢測細(xì)胞中CD117分子的表達(dá)情況。
　　4.通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，檢測細(xì)胞中CD117，CD34，DOG-1，α-SMA，及S-100的表達(dá)。
　　5.通過繪制生長曲線并計(jì)算倍增周期的方法以獲得其增殖能力特性。通過透射電鏡觀察細(xì)胞微結(jié)構(gòu)，通過核型鑒定分析染色體變異情況。
　　6.通過裸鼠皮下移植瘤形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其成瘤能力。將裸鼠按照接種細(xì)胞數(shù)目分為4組:1×104組，1×105組，5×105組，1×106組。每

11、組4只裸鼠，每只裸鼠接種一個(gè)位點(diǎn)。
　　7.通過伊馬替尼藥物殺傷實(shí)驗(yàn)明確其對伊馬替尼的敏感性，并計(jì)算出伊馬替尼對其作用的IC50（half maximal inhibitory concentration，半抑制濃度）。
　　8.通過對c-kit基因的第8、9、11、13、17外顯子及PDGFRA基因的第12、14、18外顯子測序，以明確其是否發(fā)生突變以及發(fā)生突變的位點(diǎn)及意義。
　　9.所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

12、述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，移植瘤重量的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，伊馬替尼IC50的計(jì)算采用曲線擬合分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過組織塊法，成功分離并培養(yǎng)出胃腸道間質(zhì)瘤的腫瘤細(xì)胞，而后通過傳代，凍存和復(fù)蘇逐步淘汰掉其中的成纖維細(xì)胞，并使其適應(yīng)體外生長環(huán)境，表現(xiàn)出穩(wěn)定的細(xì)胞形態(tài)及特性。
　　2.對患者腫瘤組織以及裸鼠移植瘤的免疫組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，CD117(+)、

13、CD34(+)、 DOG-1(+)、α-SMA(-)、 S100(-)。
　　3.免疫熒光檢測細(xì)胞中CD117的表達(dá)，結(jié)果表明CD117在此細(xì)胞中存在表達(dá)，表達(dá)主要位于細(xì)胞膜。
　　4.通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測細(xì)胞中的分子表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、α-SMA(-)、S100(-)，同患者腫瘤組織及移植瘤檢測的結(jié)果相同。
　　5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制生長曲線，并計(jì)算得其倍增周期為

14、24.063h。透射電鏡觀察細(xì)胞微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其細(xì)胞核明顯增大，核質(zhì)比增高，核膜清晰，核仁大，可有單個(gè)或雙個(gè)，核形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞微絨毛減少或消失。通過核型鑒定檢測其染色體變異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其染色體為亞三倍體核型的組合核型，染色體數(shù)目約為64～68條。存在涉及到Y(jié)、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、21、22等多條染色體參與的復(fù)雜數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常，包括易位、缺失、重復(fù)等。
　　6.此細(xì)胞系具

15、有高效的成瘤能力。移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1×106組最早于接種第7天出現(xiàn)肉眼可見腫瘤，而1×104組最早于第13天出現(xiàn)肉眼可見腫瘤，3周后所有接種位點(diǎn)均有肉眼可見腫瘤形成，此時(shí)收割腫瘤。重量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示移植瘤重量與接種細(xì)胞數(shù)目正相關(guān)，且各組形成移植瘤的重量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　7.使用伊馬替尼檢測其藥物敏感性并計(jì)算出IC50值，結(jié)果表明此細(xì)胞對伊馬替尼許多敏感，IC50=0.5343μmol/L。
　　8.使用外顯子

16、測序技術(shù)檢測了c-kit基因的8、9、11、13、17號外顯子以及PDGFRA基因的12、14、18號外顯子。結(jié)果顯示c-kit基因的五個(gè)外顯子及PDGFRA基因的14號外顯子未發(fā)生突變，而PDGFRA基因的12號外顯子于1701位點(diǎn)發(fā)生突變，A＞G;18號外顯子的2472位點(diǎn)C＞T。二者均為同義突變，不影響氨基酸編碼。
　　結(jié)論:
　　1.成功從患者腫瘤組織中分離培養(yǎng)出一例胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系。
　　2.此細(xì)胞系分子表