Ⅰ型糖尿病相關抗原ChgA的HAL-A-0201限制性表位的合成與鑒定.pdf

1、目的:Ⅰ型糖尿病(Type1 diabetes，T1D)是一種胰島β細胞被自身反應性CD4+和CD8+T細胞介導破壞后，胰島素分泌絕對不足而造成的自身免疫性疾病?，F已公認，在非肥胖性糖尿病(nonobese diabetic，NOD)小鼠和Ⅰ型糖尿病患者中，自身反應性CD4+T細胞和CD8+細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)均是發(fā)病中不可缺少的效應細胞。對胰島β細胞的自身免疫攻擊進行抗原特異性的免疫干

2、預與阻斷，可以重新建立機體對胰島β細胞自身抗原的免疫耐受，是一種可能從根本上預防T1D發(fā)生和發(fā)展的理想途徑，故尋找T1D發(fā)病過程中重要的靶標抗原以誘導免疫耐受具有重要意義。大多數胰島β細胞自身抗原都可以被CD4+T細胞和CD8+T細胞識別，如胰島素(insulin)、谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和胰島特定的葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關蛋白(islet-specific glucose-

3、6-phosphatase catalytic subunit-relatedprotein，IGRP)。嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A，ChgA)是近幾年剛被發(fā)現的T1D相關抗原，它可以被NOD小鼠和人類的CD4+T細胞識別，但能否被CD8+T細胞所識別還未知。HLA-A*0201是亞洲及高加索人群中的高頻等位基因（HLA-A2超型占有比例為50％），研究發(fā)現該基因與T1D高患病風險有一定相關性。國外David VS研究小

4、組建立了一個HLA-A*0201轉基因NOD小鼠模型——NOD.β2mnullHHD小鼠，并證實了該人源化NOD小鼠模型能被用于HLA-A*0201限制性的T1D優(yōu)勢CD8+T細胞表位的鑒定，從而解決了實驗研究中胰腺組織樣本極少且很難獲取，外周血中自身反應性CD8+T細胞數量極少的問題，使關于T1D患者HLA-A*0201限制性CD8+T細胞表位鑒定的研究得到了極大的發(fā)展。本研究預測并初步合成了HLA-A*0201限制性T1D相關抗原C

5、hgA的CD8+T細胞表位肽，對繼續(xù)深入研究HLA-A2超型表位有較大的參考價值，對T1D基于超型表位的耐受誘導治療提供新的候選靶標抗原表位具有一定價值。
　　方法:使用SYFPEITHI、IEDB和NETMHC三個表位預測網站進行預測，對預測結果進行綜合分析，得到與HLA-A*0201限制性候選表位肽，再應用間接熒光標記法檢測候選表位肽與HLA-A*0201的相對親和力。再進行體外細胞功能試驗，通過Elispot Assay檢測

6、候選表位肽誘導小鼠脾淋巴細胞IFN-γ表達的能力，使用[3H] thymidine摻入法檢測表位肽誘導脾淋巴細胞增殖的能力，利用以上兩個實驗對候選表位肽進行初篩;再通過胞內因子染色流式細胞術分析表位肽特異性CD8+CTL表達IFN-γ、IL-17的水平判斷其誘導細胞因子的能力，同上方法檢測其誘導表達perforin的水平以判斷細胞毒作用的大小，并利用HLA-A2抗體阻斷T2抗原提呈，以判定IFN-γ、IL-17和perforin由CD8

7、+CTL表達。結果:1.通過分析歸納SYFEPITHI、IEDB和NETMHC三個在線表位預測網站的結果，預測得到HLA-A*0201限制性的四條候選表位肽ChgA10-19、ChgA43-52、ChgA8-16和ChgA75-84。合成后通過HPLC檢測純度大于95％，通過質譜檢測分子量與理論值吻合。2.通過間接免疫熒光法檢測四條抗原表位肽與HLA-A*0201分子的相對親和力，得到各抗原表位肽的相對熒光強度FI。ChgA10-19和

8、ChgA43-52的相對熒光強度分別為2.74±0.37、3.56±0.41，高于IGRP206-2140.70±0.07，P＜0.05; ChgA8-16和ChgA75-84的相對熒光強度為0.83±0.20、0.77±0.04，與IGRP206-214對比統計學無差異，P＞0.05。與HIVpol476-4842.33±0.08對比，ChgA10-19組無差異，P＞0.05，其他三組有差異，P＜0.05。3.通過[3H]胸腺嘧啶攝取

9、法評價候選表位肽刺激脾淋巴細胞增殖，得到檢測射線的每分鐘計數次數(cpm)。ChgA10-19和ChgA43-52的CPM分別為7807±524、8166±714，高于medium3116±195，P＜0.05;ChgA8-16和ChgA75-84的CPM為3556±360、3766±334，與medium組對比統計學無差異，P＞0.05。與InA2-10組CPM8931±768對比，ChgA10-19組和ChgA43-52無差異，P＞

10、0.05，另外兩組組有差異，P＜0.05。4.通過ELISPOT斑點酶聯免疫分析檢測四條肽誘導刺激脾淋巴細胞產生IFN-γ的能力，得到IFN-γ斑點數。ChgA10-19和ChgA43-52誘導產生的斑點數分別為71.00±7.81和54.00±4.58，高于medium組23.00±4.00，P＜0.05。ChgA8-16和ChgA75-84誘導產生的斑點數分別為20.00±1.73和25.67±1.20，與medium組對比無統計學

11、意義，P＞0.05。與InA2-10組80.67±5.81相比，ChgA8-16、ChgA10-19與ChgA43-52與組有差異，P＜0.05，ChgA75-84無差異，P＞0.05。5.配合使用HLA-A*0201分子抗體，應用流式細胞術胞內因子染色檢測CD8+T細胞IFN-γ、IL-17、perforin的表達比例(％)。IFN組中，ChgA10-19(-)與ChgA43-52(-)組的比例分別為22.23±5.04和15.13±

12、3.99，高于medium組0.93±0.27，P＜0.05; ChgA10-19(+)與ChgA43-52(+)組的比例分別為0.80±0.58和0.90±0.06，與medium組對比無差異，P＞0.05。與ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差異，P＜0.05;與ChgA43-52（-）相比，ChgA43-52(+)有差異，P＜0.05。 IL-17組中，ChgA10-19(-)與ChgA43-52(-)組的比

13、例分別為52.23±7.98和45.13±5.23，高于medium組6.63±0.59,P＜0.05; ChgA10-19(+)與ChgA43-52(+)組的比例分別為6.73±0.12和6.40±0.25,與medium組對比無差異，P＞0.05。與ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差異，P＜0.05;與ChgA43-52(-)相比，ChgA43-52(+)有差異，P＜0.05。Perforin組中，ChgA1

14、0-19(-)與ChgA43-52(-)組的比例分別為17.27±2.69和15.13±173,高于medium組3.50±0.49, P＜0.05; ChgA10-19(+)與ChgA43-52(+)組的比例分別為4.63±0.38和0.77±0.09,與medium組對比無差異，P＞0.05。與ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差異，P＜0.05;與ChgA43-52(-)相比，ChgA43-52(+)有差異，