卵泡抑素在納米二氧化硅誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、伴隨納米二氧化硅(SiO2 NP)顆粒在工業(yè)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，其對人類健康的潛在危害越來越受人們關(guān)注。呼吸道是SiO2 NP主要暴露部位，因此SiO2 NP對呼吸系統(tǒng)的毒性作用得到廣泛研究。研究表明，識尚不全面。
　　卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)SSiO2 NP可引起呼吸道上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激。為應(yīng)對氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞主要通過活化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2從而促進(jìn)一些抗氧化基因、抗凋亡基因等的表達(dá)。然而，目前對Si

2、O2 NP應(yīng)激蛋白及它們作用的認(rèn)T)為一分泌性蛋白，在細(xì)胞外結(jié)合TGF-β超家族成員而使其失活，從而參與了細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和分泌等多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。本課題組近來發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞應(yīng)激如糖剝奪、缺氧時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)FST表達(dá)，高表達(dá)的FST可發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用。然而FST是否響應(yīng)SiO2 NP刺激尚不清楚。
　　為明確FST在SiO2NP引起的細(xì)胞氧化損傷中的作用，我們首先研究了SiO2NP暴露對FST表達(dá)的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

3、，SiO2NP暴露1天、2天小鼠肺組織的FST mRNA水平顯著增加。蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化結(jié)果也顯示，SiO2NP暴露后1天、7天小鼠的肺組織FST蛋白水平均顯著增加。體外結(jié)果顯示，SiO2NP處理后，肺泡上皮細(xì)胞(A549)細(xì)胞中FST mRNA和蛋白水平均顯著增加。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ST為一SiO2NP響應(yīng)蛋白。
　　FST mRNA水平的增加可能是其基因轉(zhuǎn)錄增加，也可能是其mRNA的降解減少。首先，我們利用放線菌素D抑制新

4、mRNA的合成，隨后檢測剩余FST mRNA的半衰期。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，SiO2 NP處理組FST mRNA降解速率并無改變，提示SiO2 NP并不影響FST的穩(wěn)定性。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SiO2 NP處理后FST啟動子活性顯著升高;染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ST基因啟動子區(qū)的活性染色質(zhì)標(biāo)志物Ac-H3(K9/18)以及H3K4me2水平顯著增加，表明SiO2 NP可促進(jìn)FST基因轉(zhuǎn)錄。
　　Nrf2是響應(yīng)氧

5、化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄因子。為明確Nrf2在SiO2 NP促進(jìn)FST基因轉(zhuǎn)錄的作用，我們利用siRNA抑制細(xì)胞內(nèi)N也的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FST表達(dá)水平也顯著降低。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ST啟動子區(qū)含有Nrf2的結(jié)合序列（ARE）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將Nrf2結(jié)合序列去除后，F(xiàn)ST的轉(zhuǎn)錄不再受Nrf2表達(dá)水平的影響，表明Nrf2可通過ARE序列促進(jìn)FST的表達(dá)。最后，ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Nrf2可與FST啟動子區(qū)結(jié)合，SiO2 NP處理顯著增

6、加了Nrf2與FST啟動子的結(jié)合，表明Nrf2直接結(jié)合在FST啟動子區(qū)。以上結(jié)果表明，Nrf2直接結(jié)合在FST啟動子區(qū)的ARE序列上，從而促進(jìn)FST轉(zhuǎn)錄。
　　為研究FST在SiO2 NP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的作用，我們抑制細(xì)胞內(nèi)FST表達(dá)，隨后檢測細(xì)胞凋亡。對體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞進(jìn)行AnnexinⅤ染色發(fā)現(xiàn)， SiO2 NP處理可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，利用siRNA抑制FST表達(dá)后細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明FST可減少SiO2 NP誘導(dǎo)的細(xì)

7、胞凋亡。對小鼠肺組織進(jìn)行TUNNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，SiO2NP暴露可引起終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，利用shRNA抑制FST表達(dá)后細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加。綜上所述，F(xiàn)ST在體內(nèi)、體外均可減少SiO2NP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　最后，我們研究了FST對細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響。發(fā)現(xiàn)SiO2 NP處理后，細(xì)胞內(nèi)總ROS水平顯著升高，抑制FST表達(dá)后ROS水平明顯高于對照組，而過表達(dá)FST組ROS水平顯著低于對照組。表明FST抑制細(xì)

8、胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。進(jìn)一步，我們研究了FST對GAPDH氧化酶(NOX)家族成員表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，抑制FST表達(dá)后細(xì)胞NOX1和NOX5的mRNA水平顯著性上調(diào)，而過表達(dá)FST后細(xì)胞NOX1和NOX5的mRNA水平顯著性下調(diào)。以上結(jié)果提示，F(xiàn)ST通過抑制NOX1和NOX5的表達(dá)從而抑制SiO2 NP誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。
　　綜上所述，本學(xué)位論文的主要發(fā)現(xiàn)包括:1）SiO2 NP誘導(dǎo)小鼠肺組織和培養(yǎng)的肺上皮細(xì)胞中FST的表達(dá);2）Si