p85β在p110αE545K結直腸癌發(fā)生中的作用機制及腫瘤標志物分析方法的研究.pdf

1、目的：
　　癌癥仍然是困擾人類的世界性醫(yī)學問題，探討癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制對于認清癌癥本質、攻克癌癥難題具有非常重要的意義。同時，建立與腫瘤相關的生物標志物的檢測方法，能為癌癥的早期篩查提供重要的方法學基礎。因此，本論文的研究目的有以下幾個方面:(1)研究結直腸癌細胞IRS1和p110α E545K的特征及其對下游信號的影響，探究這兩種蛋白在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用;(2)研究PI3K調(diào)節(jié)亞基p85β，在含有p110α E54

2、5K突變的結直腸癌中可能存在的新的生物學功能及其分子機制;(3)發(fā)掘發(fā)揮該生物學功能的關鍵基因信息，并探討其與p85β生物功能的相關性;(4)建立檢測與癌癥發(fā)生相關的DNA氧化性損傷生物標志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）和腫瘤標志物葉酸受體(FR1)的簡便準確的分析方法，為癌癥的早期診斷和篩查提供方法學基礎。
　　方法：
　　1.在人結直腸癌DLD1細胞和p110α只含有E545K突變型等位基因的DLD1細胞（以下簡稱D

3、LD1 Mut-only細胞）的基礎上，分別將IRS1基因敲除。利用蛋白印跡和表型分析的方法，比較敲除IRS1前后，細胞相關蛋白的表達水平變化及細胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成的能力，探究IRS1對癌細胞的重要性。
　　2.在DLD1 Mut-only細胞的基礎上，構建p110α D933A突變及p110α E545K基因敲除細胞系。利用蛋白印跡和表型分析的方法，比較突變及敲除p110α前后，細胞相關蛋白的表達水平變化及細胞凋亡

4、、平板集落和軟瓊脂集落形成的能力，探究p110α對癌細胞的重要性。
　　3.在人結直腸癌DLD1細胞、只含有野生型p110α等位基因的DLD1細胞（以下簡稱DLD1 WT-only細胞）、DLD1 Mut-only細胞、HCT116細胞、RKO細胞以及SW480細胞中，利用免疫共沉淀的方法，探討p110α、IRS1、p85α及p85β的相互作用關系。
　　4.在DLD1 Mut-only細胞基礎上，將p85β基因敲除，構建p

5、85β KO細胞系。通過表型分析（包括細胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成、裸鼠異種移植瘤模型）研究p85β基因敲除前后細胞表型的變化，從而確定p85β的生物學功能。在此基礎上，通過蛋白印跡技術研究與p85β生物學功能相關的分子機制。
　　5.在DLD1 WT-only細胞、DLD1 Mut-only細胞、HCT116 WT-only細胞(p110α只含有野生型等位基因的HCT116細胞)、HCT116 Mut-only細胞(p11

6、0α只含有H1047R突變型等位基因的HCT116細胞)中，利用免疫熒光染色及激光共聚焦技術，確定p85β的細胞定位情況。
　　6.利用“cNLS Mapper”預測p85β的關鍵核定位信息，在p85β KO細胞的基礎上，構建HA標記的野生型p85β及HA標記的關鍵核定位信號突變的p85β過表達細胞系。通過免疫熒光染色及激光共聚焦技術，對預測得到的p85β的關鍵核定位信息進行驗證。
　　7.在DLD1基礎上，利用CRISPR

7、-Cas9技術構建關鍵核定位信號突變的p85β基因敲入細胞系。通過裸鼠異種移植瘤模型，在人結直腸癌DLD1親代細胞上，驗證與p85β致癌功能相關的關鍵基因信息。
　　8.利用抗原抗體的特異性反應及免疫膠體金技術，通過吸光光度法建立與腫瘤相關的生物標志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的分析方法。
　　9.利用抗原抗體的特異性反應及免疫膠體金技術，通過共振瑞利散射法建立腫瘤標志物葉酸受體(FR)的檢測方法。
　　結果：<

8、br>　　在DLD1或DLD1 Mut-only細胞基礎上，將IRS1基因敲除后，p110α E545K的蛋白表達也隨之降低，而p85β的表達量不受影響。IRS1基因敲除后，下游pAKT表達量下降，而對MAPK信號通路無影響。敲除IRS1基因可以促進癌細胞發(fā)生自主性凋亡，抑制癌細胞的平板集落和軟瓊脂集落的形成能力，從而降低癌細胞的惡性程度。
　　p110αE545K基因突變及敲除后，IRS1和p85β的表達量均不會受到影響，下游p

9、AKT表達量下降，而對MAPK信號通路無影響。從表型分析結果看出，p110α E545K基因敲除也可以降低癌細胞的惡性程度。
　　在DLD1 WT-only和DLD1 Mut-only兩種癌細胞系中，p85α均結合在p110α上。在DLD1 WT-only癌細胞系中，p85β同時與p110α及IRS1相結合，發(fā)揮其調(diào)節(jié)亞基的作用。而在DLD1 Mut-only癌細胞系中，p85β從p110α E545K中解離下來，且解離下來的p8

10、5β也不再與IRS1發(fā)生相互結合。p85β從p110α解離下來的事實只特異于含有p110α E545K突變的細胞系，在其他人結直腸癌細胞中沒有該現(xiàn)象。
　　為研究p85β的生物學功能，我們在含有p110αE545K突變的人結直腸癌細胞系中構建了p85β基因敲除細胞系。p85β基因敲除后，癌細胞的凋亡數(shù)增加、平板集落和軟瓊脂集落數(shù)下降、在裸鼠兩側接種的異種移植瘤的形成能力降低。這些結果表明游離的p85β在含有p110αE545K突變

11、的腫瘤細胞中也具有了一定的致癌活性。分子機制研究顯示，p85β的該項功能可能與JNK/c-jun信號通路有關。
　　通過免疫熒光染色對p85β進行細胞定位時發(fā)現(xiàn)，只有在含有p110α E545K突變的人結直腸癌細胞系中，解離下來的p85β進入了細胞核，而在其他細胞中，p85β均位于胞漿。對p85β的關鍵核定位信息分析顯示，位于整個p85β氨基酸序列第477和478位的賴氨酸和精氨酸“KR”對p85β在p110α E545K突變型癌

12、細胞中入核的行為非常關鍵。將這兩個關鍵氨基酸突變成“AA”（兩個丙氨酸），然后在p85β KO細胞基礎上分別過表達野生型p85β和突變型p85β，發(fā)現(xiàn)野生型p85β質粒穩(wěn)轉后，p85β仍然入核;而突變型p85β質粒穩(wěn)轉后，p85β則在胞漿。裸鼠異種移植瘤模型結果表明，在人結直腸癌DLD1細胞基礎上，將p85β基因的“KR”突變成“AA”后，癌細胞的成瘤能力明顯減弱。以上結果說明，“KR”序列確實是p85β的關鍵入核信號，且該信號對p85

13、β的致癌性能關系重大。
　　另一方面，對與腫瘤相關的生物標志物8-OHdG的檢測結果顯示，免疫膠體金吸收波長紅移的波長數(shù)和8-OHdG的濃度呈很好的線性關系，檢測范圍0.25-5.00μg/mL，最低檢出限25 ng/mL。且隨著8-OHdG的濃度的增大，膠體金的顏色從紅逐漸變紫甚至變藍，根據(jù)顏色的變化實現(xiàn)了8-OHdG的半定量可視化檢測。透射電鏡結果顯示，波長的移動和顏色的變化與膠體金聚集狀態(tài)有關。
　　通過共振瑞利散射的

14、信號增強和濃度之間的線性關系實現(xiàn)了對葉酸受體FR1的簡單快速定量測定。線性范圍0.50-37.50 ng/mL，最低檢出限0.05 ng/mL。利用共振瑞利散射作為響應信號，大大提高了檢測方法的靈敏度。
　　結論：
　　在結直腸癌分子機制的研究中，我們發(fā)現(xiàn)IRS1及p110α E545K對于DLD1癌細胞形成的腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要，二者通過AKT信號通路發(fā)揮致癌作用。在含有p110αE545K突變的人結直腸癌DLD1細胞中

15、，p85其中的一種亞型p85β從p110α E545K蛋白上特異性地解離下來，解離下來的p85β也不再與IRS1結合。游離的p85β特異性的進入了含有p110α E545K突變的DLD1癌細胞的細胞核中。入核后的p85β本身也具有了一定的致癌活性，且p85β的入核行為及致癌活性與其序列中位于第477位和478位的“KR”具有重要相關性。在與腫瘤相關的生物標志物的分析方法方面，我們成功建立了兩種標志物（8-OHdG和FR1）的檢測方法，該

16、方法具有快速方便，操作簡單，選擇性好等優(yōu)點。
　　本論文的創(chuàng)新性：
　　(1)發(fā)現(xiàn)了不與p110α結合的獨立的p85β的新的生物學功能，并揭示了發(fā)揮該新生物學功能的關鍵基因信息，為腫瘤藥物設計篩選和臨床治療提供一個極具前景的新靶點。
　　(2)建立了兩種與腫瘤相關的生物標志物的簡單快速的分析檢測方法，為癌癥的早期診斷提供重要的方法學理論依據(jù)。
　　局限陛及未來計劃：
　　本文仍存在局限性，表現(xiàn)在:(1)對基

17、于DLD1構建的p85β KR突變基因敲入細胞的表型分析不夠全面;(2)對可能影響p85β生物學功能的分子機制的研究不夠深入明晰;(3)實驗建立的對8-OHdG的檢測方法的靈敏度有待進一步提高。
　　針對以上不足，未來將對實驗進行完善和優(yōu)化。(1)對p85β KR突變基因敲入細胞進行多種表型分析，如細胞凋亡、集落形成及軟瓊脂等實驗;(2)查閱文獻，進一步分析研究影響p85β生物學功能的下游信號通路，找到能合理解釋p85β致癌活性的