基于代謝組學(xué)的補骨脂安全性評價及補骨脂酚的體內(nèi)代謝研究.pdf

1、目的：采用超高效液相色譜/四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-PDA-Q-TOF-MS）儀器，利用其高分離性、高分辨率的特點，對中藥補骨脂成份進行快速定性分析，在化學(xué)層面上為探究補骨脂藥效及毒性機制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；采用基于UPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)的方法，研究補骨脂醇提物和水提物連續(xù)灌胃2周后，對大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響，尋找并鑒定差異性代謝物，并結(jié)合其對大鼠血常規(guī)、血生化的影響及病理檢測結(jié)果，從分子層面上為闡釋補骨脂的藥效和毒性機

2、制提供依據(jù)；采用UPLC-PDA-Q-TOF-MS儀器，測定大鼠灌胃給予補骨脂酚后血漿、膽汁、尿液和糞便中代謝產(chǎn)物，并探討補骨脂酚主要代謝產(chǎn)物血漿動力學(xué)特征，通過研究補骨脂酚體內(nèi)代謝物譜及其代謝特點，從藥物體內(nèi)代謝層面上為研究補骨脂酚體內(nèi)代謝產(chǎn)物的安全性奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：①補骨脂采用70％乙醇滲漉提取，經(jīng)過濾后，采用旋蒸儀濃縮，真空冷凍干燥。分別稱取少量樣品，甲醇溶解，過濾膜后，UPLC-PDA-Q-TOF-MS進樣分析。

3、②雄性SD大鼠分為4組，每組6只，分別給予補骨脂醇提物、補骨脂水提物0.54，1.08和1.62 g·kg-1，每天1次，連續(xù)給藥2周，末次給藥后，禁食24h，采集全血、血清及心、肝、腎等組織。采用自動血常規(guī)分析儀獲得血常規(guī)結(jié)果，采用自動血生化儀獲得血生化結(jié)果，采用HE染色切片觀察獲取其組織病理結(jié)果，應(yīng)用超高效液相色譜/四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）分析血清樣品，MassLynx采集并處理數(shù)據(jù)，采用偏最小二乘判別分析（

4、PLS-DA）方法，分析各組大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的差別，通過正交偏最小二乘法（OPLS-DA）、變量重要程度（VIP）篩選潛在生物標(biāo)志物并測定其相對含量。③16只雄性SD大鼠適應(yīng)一周后，隨機分成3組，即尿液和糞便收集組、血漿收集組、膽汁收集組。尿液和糞便收集組給藥前開始24h在代謝籠中適應(yīng)，先采用代謝籠收集12 h的空白尿液與糞便，給藥前24h禁食。給予補骨脂酚（500 mg·kg-1）后自由飲水，并立即開始收集尿液和糞便，收集24h

5、糞便和尿液；膽汁收集組給藥前12h禁食。大鼠分成兩組，采用PE-10導(dǎo)管總膽管插管，一組給予空白溶媒，另一組給予補骨脂酚（500 mg·kg-1），收集24h膽汁；血液采集組給藥前12 h禁食，給予補骨脂酚（500 mg·kg-1），分別于給藥前，給藥后0.5、1、2、4、8、12、24 h眼眶取血。所有樣品經(jīng)處理后，UPLC-PDA-Q-TOF-MS進樣分析，利用Metabolynx4.0軟件和質(zhì)量虧損（MDF）技術(shù)等方法尋找代謝物，

6、通過比對補骨脂酚和代謝產(chǎn)物的準確分子量、二級質(zhì)譜碎片和紫外吸收，確定未知代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：①從紫外圖譜中看出有14種成分的含量較高，選擇14種成分進行二級質(zhì)譜分析，通過比對對照品及文獻中的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)、色譜保留順序等，推測出12個化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，它們分別是補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂黃酮、補骨脂定、補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、異補骨脂查爾酮等和補骨脂酚等。②連續(xù)給予補骨脂醇提物（EEFP）2周后，

7、與空白組相比，給藥兩周后，血常規(guī)中白細胞（WBC）、單核細胞（MON）和中性粒細胞(NEUT)呈劑量依賴性上升趨勢，與空白組比較，高劑量組具有顯著性差異；血小板（PLT）和血小板壓積（PCT）呈劑量依賴性下降趨勢，與空白組比較，高劑量組具有顯著性差異。血生化中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）呈劑量依賴性上升趨勢，與空白組比較，高劑量組具有顯著性差異；肌酐（CRE）呈劑量依賴性上升趨勢，與空白組比較，高劑量組具有顯著性差異。病理組織結(jié)果中，正常對照組

8、肝組織結(jié)構(gòu)完整，清晰，細胞形態(tài)規(guī)則，未見水腫、凋亡、壞死及炎性細胞，EEFP（1.08g/kg)和EEFP（1.62g/kg）組肝臟組織可見部分肝細胞壞死，炎癥浸潤，其中以EEFP（1.62g/kg）組壞死最為明顯；心臟和腎臟均未見有明顯的變化。通過基于UPLC-Q-TOF-MS的血清代謝組學(xué)分析，共鑒定出10種差異性代謝物，它們分別是溶血磷脂酰膽堿（LysoPC(20:4)）、甘油磷脂（PGP(18:1/22:6)）、磷脂（PC(14

9、:1/20:5)、PC(14:1/16:1)、PC(22:2/18:1)）、磷脂酰乙醇胺（PE(22:1/18:1)）、肌酐二磷酸（IDP）、對甲酚（p-Cresol）、對甲酚硫酸鹽（p-Cresol sulfate）和抗壞血酸（Ascorbic acid），與空白對照組比較，各EEFP給藥組中溶血磷脂酰膽堿（LysoPC(20:4)）、甘油磷脂（PGP(18:1/22:6)）含量呈升高趨勢，磷脂（PC(14:1/20:5)、PC(14

10、:1/16:1)、PC(22:2/18:1)）、磷脂酰乙醇胺（PE(22:1/18:1)）、肌酐二磷酸（IDP）、對甲酚（p-Cresol）、對甲酚硫酸鹽（p-Cresol sulfate）和抗壞血酸（Ascorbic acid）呈下降趨勢。③連續(xù)給予補骨脂水提物2周后，與空白組相比，白細胞（WBC）含量呈劑量依賴性上升趨勢但無顯著性差異；血小板（PLT）和血小板容積（PCT）含量呈下降趨勢，其中中劑量組（1.08 g/kg）下降較為明

11、顯；淋巴細胞（LYM）、單核細胞（MON）以及中性粒細胞（NEUT）含量呈劑量依賴性上升趨勢，其中中劑量組（1.08 g/kg）和高劑量組（1.62 g/kg）上升較為明顯；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及尿素（UREA）含量呈劑量依賴性下降趨勢，其中中劑量組（1.08 g/kg）和高劑量組（1.62 g/kg）下降較為明顯。通過代謝組學(xué)方法，初步篩選出5種生物標(biāo)志物，它們分別是吲哚、L-苯丙氨酸、植物鞘氨醇、乳酸和芽子堿甲，與空白組相比，各給

12、藥組吲哚、L-苯丙氨酸和植物鞘氨醇含量呈上升趨勢，乳酸和芽子堿甲酯含量呈下降趨勢。④通過對給予補骨脂酚大鼠血漿、尿液、膽汁和糞便的分析，共鑒定出11種補骨脂酚的體內(nèi)代謝產(chǎn)物（M1-11)，血漿中存在6種，膽汁中存在10種，尿液中存在8種，糞便中存在2種，它們主要是補骨脂酚的氧化、羥基化、甲基化、O-葡萄糖醛酸化結(jié)合以及O-硫酸化結(jié)合產(chǎn)物，血漿中M1和M5的動力學(xué)結(jié)果顯示，M1的含量在給藥后12h后達到峰值，其穩(wěn)態(tài)一直維持到給藥后24h，

13、而M5的量在給藥后4h達峰值，然后緩慢下降。
　　結(jié)論：①本實驗采用超高效夜相-四級桿-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實現(xiàn)了對補骨脂醇提物中多成分的快速定性分析，鑒定出12種成分，它們分別是香豆素類如補骨脂素、異補骨脂素，黃酮類如補骨脂黃酮等，查爾酮類如異補骨脂查爾酮等，以及單萜類如補骨脂酚。②補骨脂醇提物給藥2周后，血常規(guī)、血生化以及肝臟組織病理學(xué)結(jié)果表明，長期大劑量服用補骨脂醇提物會引起肝損傷；血清代謝組學(xué)結(jié)果顯示，10種內(nèi)源性物質(zhì)

14、發(fā)生明顯改變，提示其與補骨脂醇提物肝毒性相關(guān)，為潛在毒性標(biāo)志物，通過對各物質(zhì)代謝通路分析，其分析結(jié)果與傳統(tǒng)藥理學(xué)的血常規(guī)、血生化檢測和病理組織結(jié)果基本一致。③補骨脂水提物給藥2周后，血常規(guī)、血生化的結(jié)果表明，補骨脂具有明顯的抗凝血作用和提高腎功能作用以及潛在的毒性；血清代謝組學(xué)結(jié)果顯示，5種內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生顯著改變，各物質(zhì)代謝通路分析結(jié)果表明，補骨脂水提物發(fā)揮藥效和毒性的機制可能是通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝、磷脂代謝以及糖酵解過程來實現(xiàn)的。④在本

15、研究中，UPLC/ESI-PDA-QTOF-MS聯(lián)合MetaboLynx XS軟件及MDF技術(shù)被成功用于識別補骨脂酚在大鼠血漿、膽汁、尿和糞便中的代謝物。共鑒定出11種代謝產(chǎn)物，初步確定其體內(nèi)可能的代謝途徑，并對補骨脂酚血漿中主要代謝物M1和M5進行了動力學(xué)的研究。在11種代謝產(chǎn)物中，氧化產(chǎn)物和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物（M1，2，5）為骨脂酚體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，M1主要存在于血清和尿中，M2主要存在于尿和膽汁中，M5主要存在于膽汁和血清中。M1