母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜合征的生物學(xué)特征及同型半胱氨酸損傷機(jī)制.pdf

1、腸易激綜合征(IBS)是一種以腹痛/腹部不適伴排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯某Ｒ姷墓δ苄阅c病，其發(fā)作具有持續(xù)或反復(fù)的特點(diǎn)，缺乏形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變的生物學(xué)標(biāo)志，腸道運(yùn)動紊亂和內(nèi)臟感覺過敏被認(rèn)為是其重要的病理生理改變。其發(fā)病率高，且發(fā)病以中青年為主，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。該病病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，流行病學(xué)調(diào)查顯示，80％ IBS患者中，應(yīng)激可造成IBS癥狀發(fā)作或加重，有精神創(chuàng)傷史者IBS發(fā)病率明顯高于健康人群，而長期的精神心理應(yīng)激刺激將對IBS產(chǎn)生

2、直接致病作用。本研究探討應(yīng)激誘導(dǎo)IBS發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)及其損傷機(jī)制，為深刻認(rèn)識IBS的病理生理機(jī)制、探索其臨床診斷與有效防治措施提供靶點(diǎn)和科學(xué)依據(jù)。
　　一、母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜合征的生物學(xué)特點(diǎn)
　　新生期母嬰分離(MS)是一種早期負(fù)性生活應(yīng)激事件，可誘導(dǎo)出大鼠IBS主要病理特征即內(nèi)臟痛覺過敏和應(yīng)激時(shí)結(jié)腸運(yùn)動加強(qiáng)。本研究選用SD新生大鼠，采用新生期母嬰分離方法建立應(yīng)激致腸易激綜合征大鼠模型，母嬰分離時(shí)間為PND（出生后

3、天數(shù)）2-PND21，每天分離3h。按照功能性疾病診斷方法，以大鼠行為學(xué)（曠場試驗(yàn)和蔗糖水偏嗜度試驗(yàn)反映動物精神活動）、大便性狀及排泄率（單位時(shí)間內(nèi)的動物排便粒數(shù)反映其胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能）、結(jié)腸組織病理學(xué)和內(nèi)臟敏感性（結(jié)直腸擴(kuò)張—腹部回撤反應(yīng)壓力閾值反映動物內(nèi)臟敏感性）等疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)腸易激綜合征疾病動物模型的建立。
　　結(jié)果顯示，與對照組相比，模型大鼠內(nèi)臟疼痛壓力閾值顯著下降，內(nèi)臟敏感性增強(qiáng)，急性應(yīng)激后腸道轉(zhuǎn)運(yùn)加快;出現(xiàn)糖水消耗量

4、下降、探究行為減少及排便數(shù)量顯著增加等抑郁、焦慮樣行為學(xué)改變;H-E染色可見結(jié)腸各段組織結(jié)構(gòu)完整，未見病理學(xué)改變;大鼠未見生長遲滯，新生期及成年后體重增長未見異常，符合IBS臨床表型特征，表明新生期母嬰分離應(yīng)激3h致IBS大鼠模型成功建立。對IBS大鼠生物學(xué)特點(diǎn)研究結(jié)果表明，新生期母嬰分離應(yīng)激致大鼠IBS樣癥狀存在性別差異，表現(xiàn)為雌鼠較雄鼠腸道敏感性增高更明顯，這與臨床女性發(fā)病率高于男性相似;分離3h和分離4.5 h的不同應(yīng)激時(shí)間對IB

5、S大鼠癥狀嚴(yán)重程度未造成明顯影響;單純分離和分離附加孤養(yǎng)的不同應(yīng)激類型對IBS大鼠癥狀嚴(yán)重程度亦未造成明顯影響。
　　母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜合征的生物學(xué)基礎(chǔ)的探索
　　本研究選取母嬰分離應(yīng)激3h建立IBS大鼠模型，鑒于雌性動物涉及較多的變量因素且多不可控如激素周期的影響，選取雄性大鼠開展下列研究:
　　1.母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜合征的神經(jīng)內(nèi)分泌基礎(chǔ)
　　采用ELISA方法分別檢測大鼠血漿GC、NE、Ach、5-H

6、T、CGRP、SP和GAS濃度。結(jié)果顯示，母嬰分離應(yīng)激致IBS發(fā)病過程中引起HPA軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)異常活化，模型大鼠血漿CORT和Ach濃度較對照組顯著升高;血漿SP、GAS和5-HT水平輕度升高，CGRP濃度顯著升高。急性束縛應(yīng)激2h后，上述指標(biāo)均呈現(xiàn)持續(xù)而顯著升高。提示神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂可能是應(yīng)激致IBS的生物學(xué)基礎(chǔ)。母嬰分離大鼠成年后上述神經(jīng)內(nèi)分泌激素持續(xù)高水平，表明早期生活事件引起神經(jīng)內(nèi)分泌長期異常，導(dǎo)致對應(yīng)激反應(yīng)的易感性。

7、　　2.母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜合征的炎癥機(jī)制
　　采用ELISA方法分別檢測大鼠血漿炎性因子TNF-α和NO水平，可見模型大鼠血漿TNF-α水平較對照組顯著升高，急性束縛應(yīng)激后進(jìn)一步增加，且與對照應(yīng)激組有顯著差異;而血漿NO含量明顯降低，急性應(yīng)激后進(jìn)一步下降;甲苯胺藍(lán)病理染色觀察可見結(jié)腸肥大細(xì)胞活化，結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞數(shù)目和脫顆粒比例較對照組增加，表明母嬰分離應(yīng)激致IBS發(fā)病過程中存在炎癥反應(yīng)。
　　3.母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜

8、合征的代謝機(jī)制
　　采用代謝組學(xué)技術(shù)分析母嬰分離應(yīng)激致IBS大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，定性分析發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)激造成機(jī)體氨基酸、糖類及脂類共45種代謝產(chǎn)物發(fā)生異常改變，其中7種代謝分子包括絲氨酸、甘氨酸及纈氨酸等在母嬰分離組明顯增高，上述氨基酸參與腸道內(nèi)多種生物活性物質(zhì)的合成與調(diào)節(jié)，對維持腸黏膜完整性和腸道功能意義重大，表明母嬰分離應(yīng)激致IBS發(fā)病過程中機(jī)體形成腸易激綜合征易感的代謝模式。
　　采用HPLC方法檢測血漿中Hcy水平，

9、發(fā)現(xiàn)模型大鼠血漿Hcy水平顯著升高，急性應(yīng)激后進(jìn)一步升高，出現(xiàn)Hcy代謝異常，但早期應(yīng)激與成年后急性應(yīng)激的疊加效應(yīng)不明顯。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，模型大鼠血漿絲氨酸含量顯著升高，絲氨酸是Hcy轉(zhuǎn)硫代謝的關(guān)鍵底物，Western blot顯示結(jié)腸組織Hcy轉(zhuǎn)硫代謝酶胱硫醚β-合成酶(CBS)表達(dá)水平下降，表明在母嬰分離應(yīng)激致IBS進(jìn)程中Hcy轉(zhuǎn)硫代謝受到抑制，導(dǎo)致Hcy代謝異常。
　　應(yīng)激所致氨基酸等代謝模式異?？赡苁悄笅敕蛛x應(yīng)激致IBS

10、發(fā)病的分子基礎(chǔ)。Hcy作為前炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)分子，其代謝異?？赡軉踊蚪閷?dǎo)了母嬰分離應(yīng)激所致IBS的病理過程。
　　三、 Hcy在母嬰分離應(yīng)激致腸易激綜合征發(fā)病中的損傷機(jī)制
　　1.Hcy是母嬰分離應(yīng)激致IBS發(fā)生的重要介導(dǎo)因子
　　為了觀察Hcy在母嬰分離應(yīng)激致IBS發(fā)生中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用外源性補(bǔ)充Hcy代謝輔酶復(fù)合物（葉酸、維生素B6、維生素B12和甜菜堿復(fù)合水溶液）調(diào)節(jié)機(jī)體Hcy水平，將IBS模型大鼠隨機(jī)分為

11、兩組，一組給予Hcy代謝輔酶(MS+ VitB)，一組給予水(MS)，灌胃體積2 ml，連續(xù)7天;對照組為不接受分離應(yīng)激大鼠，給予水灌胃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充Hcy代謝輔酶組大鼠血漿Hcy水平較模型大鼠顯著降低，下降了30％，但仍略高于對照組Hcy水平。伴隨血漿Hcy水平的降低， IBS大鼠腸道內(nèi)臟高敏和轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)癥狀明顯改善，同時(shí)血漿炎性因子TNF-α水平隨之降低，進(jìn)一步確認(rèn)Hcy介導(dǎo)了母嬰分離應(yīng)激致IBS的發(fā)生。
　　2.Hcy對母嬰

12、分離應(yīng)激致IBS大鼠腸道屏障功能的調(diào)控
　　為了探討Hcy介導(dǎo)母嬰分離應(yīng)激致IBS的生物學(xué)機(jī)制，首先，通過三糖試驗(yàn)觀察Hcy對腸道通透性的影響。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定尿液中不同時(shí)間段內(nèi)甘露醇、乳果糖和三氯蔗糖三種糖分子探針含量，發(fā)現(xiàn)灌服三糖分子水溶液后0-5 h，各組大鼠尿液中甘露醇排泄量未見差別，模型大鼠乳果糖排泄量較對照組顯著增加，乳果糖/甘露醇比值顯著增高，補(bǔ)充Hcy代謝輔酶后明顯下降;6-2

13、4 h模型大鼠尿液中三氯蔗糖排泄量亦較對照組顯著增加，給予維生素后明顯降低，表明母嬰分離應(yīng)激致IBS進(jìn)程中腸道細(xì)胞旁通透性增高，腸道上皮機(jī)械屏障功能受損，調(diào)節(jié)Hcy水平后此損傷效應(yīng)明顯減輕。
　　采用透射電鏡觀察Hcy對結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)完整性的影響，發(fā)現(xiàn)模型大鼠結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，與對照組相比，緊密連接疏松、間隙增寬、密度降低，調(diào)節(jié)Hcy水平后，結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性得以恢復(fù)。
　　采用Western b

14、lot和免疫熒光方法觀察Hcy對結(jié)腸上皮緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)及分布的影響，發(fā)現(xiàn)模型大鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)水平較對照組顯著減少，補(bǔ)充Hcy代謝輔酶后表達(dá)量的降低有所減緩;模型大鼠結(jié)腸黏膜上皮occludin分布發(fā)生改變，陽性染色變淡，分布不連續(xù)，調(diào)節(jié)Hcy水平后上述改變有所緩解，提示母嬰分離應(yīng)激致IBS進(jìn)程中，結(jié)腸緊密連接受到破壞，導(dǎo)致結(jié)腸旁細(xì)胞通透性增加，出現(xiàn)上皮屏障功能障礙，調(diào)控Hcy水平對母嬰分離應(yīng)

15、激誘導(dǎo)的IBS模型大鼠腸黏膜屏障損傷具有一定的修復(fù)作用。表明Hcy可能是通過損傷腸道緊密連接屏障進(jìn)而介導(dǎo)了IBS的病理過程，而occludin可能是Hcy介導(dǎo)IBS的分子基礎(chǔ)。
　　3.Hcy破壞緊密連接蛋白的作用機(jī)制
　　為了進(jìn)一步研究Hcy對腸黏膜機(jī)械屏障功能的損傷機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞建立體外結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接模型，給予低濃度Hcy（不造成細(xì)胞凋亡的濃度）與TNF-α單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)24 h，采用Wester

16、n blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)和分布變化，結(jié)果顯示，Hcy干預(yù)引起occludin表達(dá)減少，occludin蛋白由細(xì)胞膜頂端向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)分布異常。提示Hcy可直接破壞細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，引起細(xì)胞旁通路開放，造成腸道通透性增高，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。即Hcy單獨(dú)啟動了腸道上皮緊密連接的破壞，而不需要TNF-α的介導(dǎo)作用。
　　綜上所述，新生期母嬰分離3h應(yīng)激可導(dǎo)致IBS發(fā)生，發(fā)病特點(diǎn)具有

17、性別差異，表現(xiàn)為與雄性大鼠相比，雌性大鼠對應(yīng)激更易感。應(yīng)激所致神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫炎癥及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂造成腸道黏膜損傷和防御機(jī)制失衡，腸道屏障功能下降，是母嬰分離應(yīng)激致IBS易感的病理生理基礎(chǔ)。Hcy代謝異常是母嬰分離應(yīng)激致IBS的重要介導(dǎo)因子，其可通過改變腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin水平和分布，引起腸道上皮細(xì)胞旁通透性增高，腸道上皮機(jī)械屏障功能受損，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使腸道處于低度炎性環(huán)境，造成腸道感覺和運(yùn)動功能異常，從而導(dǎo)致