動態(tài)高壓微射流技術(shù)對酶的活性與構(gòu)象變化的影響.pdf

1、動態(tài)高壓微射流(DHPM)是一種新興的非熱技術(shù)，集高速撞擊、高頻振蕩、瞬時壓降、高速剪切和氣穴作用于一體，壓力可高達(dá)200MPa，這種新技術(shù)不僅基于高壓能力，并且基于不同幾何學(xué)設(shè)計的反應(yīng)腔(chamber)而獲得10-15倍傳統(tǒng)閥式均質(zhì)機，連續(xù)操作費時短也不同于靜高壓。本課題旨在研究DHPM對多酚氧化酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的活性與構(gòu)象變化的影響，尤其關(guān)注的是在去折疊態(tài)下酶學(xué)性質(zhì)、動力學(xué)、穩(wěn)定性和構(gòu)象變化的分子機理。
　　 本文

2、研究了中國早酥梨多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)和動力學(xué)，以鄰苯二酚為底物，測得其Vmax為289.2units/min和Km為3.8 mmol/L，表明早酥梨多酚氧化酶對鄰苯二酚具有較高的親和性；催化反應(yīng)速率與其濃度成正比；最適pH和溫度分別為4.5和45℃。研究了DHPM對早酥梨多酚氧化酶活性影響，表明隨著處理壓力增加，相對活性從未處理的100％升高至180MPa的182.5％；同等壓力下，相對活性隨著處理次數(shù)的增加而增加；酶液溫度(25、35

3、和45℃)在120和140 MPa處理條件下影響較大。
　　 DHPM對香菇多酚氧化酶處理也是活性升高。處理壓力和次數(shù)對香菇多酚氧化酶有顯著影響，在110MPa處理一次，其相對活性最高達(dá)110.7％；在150MPa處理1-3次，其相對活性分別增加10.4％、10.9％和11.57％，處理3次后相對活性為111.5％。研究了香茹多酚氧化酶的活性與分子構(gòu)象的機理，圓二色譜顯示其二級結(jié)構(gòu)如α-helix遭到破壞，揭示相對活性的提高與其

4、α-helix含量下降有關(guān)，熒光光譜顯示香茹多酚氧化酶的Trp和Tyr殘基或多或少暴露于溶劑中，這一結(jié)果與紫外光譜分析相符，巰基測定表明香菇多酚氧化酶表面的巰基基團含量增加。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)DHPM處理后，香茹多酚氧化酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子構(gòu)象處于去折疊態(tài)。
　　 DHPM對胰蛋白酶的活性沒有顯著影響，80、100、120和160 MPa處理后，胰蛋白酶相對活性分別保留98.5％、98.3％、97.8％和97％。但DHPM處理顯著提

5、高了胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，表現(xiàn)在：45℃保溫100min后，未經(jīng)處理的胰蛋白酶殘留活性為86％，而經(jīng)DHPM80MPa處理的胰蛋白酶殘留活性為96％；DHPM對胰蛋白酶最適pH值沒影響，而經(jīng)DHPM80、100和120MPa處理后，胰蛋白酶在最適pH(pH=7.6)的活性有所提高，相對活性分別為97％，102％及103％。對胰蛋白酶構(gòu)象變化分析表明，動態(tài)高壓微射流處理后胰蛋白酶熒光強度增強、游離巰基含量增加，總巰基含量減少、紫

6、外吸收強度減弱、α-helix強度減弱。這說明DHPM處理導(dǎo)致胰蛋白酶的分子構(gòu)象部分去折疊態(tài)。這一成果進(jìn)一步印證我們關(guān)于天然熱力學(xué)最穩(wěn)態(tài)不一定是其活性最高態(tài)的理論假設(shè)。
　　 胰蛋白酶經(jīng)DHPM處理后構(gòu)象部分去折疊態(tài)導(dǎo)致其反應(yīng)穩(wěn)定性增強。根據(jù)熱動力學(xué)假設(shè)，去折疊態(tài)的胰蛋白酶并不是處在能量最低狀態(tài)，而是處于一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的過渡態(tài)，隨時可能進(jìn)行refolding或聚集而喪失其反應(yīng)穩(wěn)定性。我們提出新的設(shè)想：在酶(或蛋白質(zhì))的過渡性構(gòu)

7、象中，通過Patchthe surface(補丁法)、Dowel the exposed amino acid(樁法)、Weddge in gapbetween amino acids(楔法)三種方式來固定其不穩(wěn)態(tài)的去折疊態(tài)構(gòu)象從而維持其更高活性的策略和理論設(shè)想。本實驗采用mPEG-SC修飾即補丁法策略，結(jié)果表明：與天然胰蛋白酶(NT)相比，經(jīng)DHPM處理后unfolding胰蛋白酶(DT)經(jīng)mPEG-SC修飾后(NTP、DTp)，其儲

8、存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性顯著增強。在4℃貯存8后，NT和NTP變化不大，分別保持61％和59.9％；80和100MPa不同壓力處理下經(jīng)mPEG-SC修飾的D80TP和D100TP相對活性分別保持在78％和74％，而未修飾的D80T和D100T相對活性分別陡降到56.5％和50％；熱穩(wěn)定性方面，55℃處理10 min后，D80TP和D100TP相對活性均保持在87％左右，而D80T和D100T僅存70％的相對活性。目前學(xué)術(shù)界對熱穩(wěn)定性機理沒有統(tǒng)

9、一的解釋，認(rèn)為導(dǎo)致酶或蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的原因主要有以下幾個方面：表面疏水性/親水性的變化、表面電荷分布的變化、熱變性速率和自水解速率的降低、氫鍵的形成及解鏈溫度的降低。本實驗表明mPEG-SC修飾后，去折疊的胰蛋白酶分子內(nèi)殘基之間的相互作用以及殘基和介質(zhì)之間的相互作用發(fā)生了變化，導(dǎo)致去折疊胰蛋白酶的分子構(gòu)象發(fā)生變化，可能是其熱穩(wěn)定性增強的原因。
　　 比較分析DHPM不同chamber(美國Microfluidics公司M-cha

10、mber和中國廊坊通用機械公司的反應(yīng)腔L-chamber)對木瓜蛋白酶性質(zhì)和構(gòu)象變化影響的結(jié)果表明，兩種chamber都導(dǎo)致木瓜蛋白酶活性降低，巰基含量升高。160 MPa下處理三次后，M-chamber處理的木瓜蛋白酶(MP)相對活性降低至76.02％，巰基含量增加至110.89％，而L-chamber處理的木瓜蛋白酶(LP)相對活性保留在86.28％，巰基含量為105.36％；MP紫外吸收峰發(fā)生藍(lán)移，酪氨酸和色氨酸的熒光最大發(fā)射峰紅

11、移而LP紫外吸收和熒光光譜幾乎沒有變化。實驗表明在相同的處理壓力和處理條件下，不同的chamber仍會導(dǎo)致木瓜蛋白酶產(chǎn)生不同的性質(zhì)和構(gòu)象變化，從而證實了我們所提出的“偽壓”現(xiàn)象。
　　 通過PyMOLWin軟件構(gòu)造出天然木瓜蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模式。在此基礎(chǔ)上并根據(jù)實驗中測得的去折疊態(tài)木瓜蛋白酶的構(gòu)象變化，預(yù)測了M-chambers處理后去折疊態(tài)木瓜蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)圖。與天然木瓜蛋白酶相比，去折疊態(tài)木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)更加松散、二硫鍵斷裂、