殼聚糖納米分散體系構建及抑菌性能研究.pdf

1、殼聚糖(CS)是一種具有廣譜抑菌性的陽離子多糖。近年來，對于CS及其衍生物的抑菌機理研究已經有了長遠的發(fā)展，但其確切的抑菌機理只有一些推論性的報道。而且在以往對CS抑菌機理的研究中，大多是在溶液狀態(tài)下研究CS的抑菌行為。本文構建了一種新型的CS納米分散體系，采用界面接觸抑菌的新方法，進行CS的抑菌行為和細菌的生物化學信息變化的探索研究。 采用酸水解法制備了三種不同分子量(Mw)的殼聚糖，Mw分別為1100 kDa、300 kD

2、a和38 kDa，而且各個樣品的脫乙酰度基本相同。CS與油酰氯反應制備了油酰殼聚糖(OCS)復合物，紅外光譜中的特征吸收峰表明油?；鶊F已經成功引入了CS分子中，并計算得出OCS的取代度(DS)分別為11％、5％和2.5％。采用乳化法由OCS制備的油酰殼聚糖納米球(OCNP)呈球形且形態(tài)完整。粒徑分布表明，納米球大小均一，平均粒徑為275.3nm(樣品C)和327.4nm(樣品B)。OCNP在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中較CS和OCS具有更好的分散性

3、，是一種良好的固相分散體系。 OCNP對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均具有抑制作用，但抑菌效果存在明顯差異。測定了納米球濃度、殼聚糖Mw、油酰殼聚糖DS、體系pH值4個因素對OCNP抑菌活性的影響。結果表明OCNP在以上4個因素的作用下對于不同菌種生長的影響是不同的。殼聚糖納米分散體系對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著體系中納米球濃度的增加而增強。對于大腸桿菌，五種OCNP的最低抑菌濃度(MIC)從31.25mg/L

4、至125mg/L不等；對于金黃色葡萄球菌，五種OCNP的MIC均為125mg/L。殼聚糖Mw對OCNP抑菌活性的影響因菌種而異。在針對大腸桿菌的抑菌試驗中，低分子量(Mw=38 kDa)CS制備的OCNP具有更強的抑菌活性。而在金黃色葡萄球菌的試驗中，不同Mw殼聚糖制備的OCNP其MIC相同，抑菌活性沒有明顯差異。油酰取代度對納米球抑菌活性的影響也受到不同受試菌的影響。中取代度(DS5％)的OCNP對大腸桿菌的抑制作用最明顯；不同油酰取

5、代度納米球對金黃色葡萄球菌的抑制生長效果一致。在所試的pH范圍(pH4-6)內，納米分散體系對兩種細菌的抑菌活性隨體系pH值的升高而增強，pH達到6時其抑菌活性最強。殺菌試驗結果表明，納米分散體系能在5 min內殺死90％以上的細菌，與CS的殺菌能力相當。 OCNP對細菌細胞膜的通透性和超微形態(tài)具有明顯的影響。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌經OCNP處理后A260迅速增加，表明在納米球的作用下胞內的DNA，RNA等大分子迅速釋放到

6、胞外，細胞膜的完整性被破壞。而鎂離子的加入使胞內物質的釋放大幅下降，有效的穩(wěn)定了細胞膜結構，說明OCNP對細胞壁上鎂離子的螯合作用是其抑菌性能的一部分。針對革蘭氏陰性菌特殊的細胞外膜和內膜結構，首先采用疏水性熒光探針1-N-苯基-萘胺(NPN)，以NPN在外膜破壞后進入胞內環(huán)境中時熒光強度的增加，證明了OCNP對大腸桿菌外膜結構滲透性的影響；對細菌內膜滲透性的檢測以o-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)為底物，胞內的β-半乳糖苷酶在

7、細菌內膜受損后可以釋放至胞外，作用于ONPG后生成鄰硝基苯酚，鄰硝基苯酚含量的顯著升高，證明OCNP使大腸桿菌內膜滲透性增加。而細菌懸液中電導率的升高再次證明了OCNP增大了細菌細胞膜的通透性。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果顯示，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中的蛋白含量減少，分析其原因是OCNP破壞了細胞膜的完整性，導致了胞內可溶性蛋白的外滲，或是抑制了某些蛋白的合成。培養(yǎng)基中糖含量沒有發(fā)現明顯的變化。通過透射電鏡(TEM)觀察

8、到了OCNP對細菌的抑制作用過程。結果證明納米球可以結合在細菌表面，通過界面抑制作用產生抑菌行為，進而在細菌表面形成孔洞或破壞膜功能。直觀的證實了OCNP與細菌表面的吸附、結合是其發(fā)揮抑菌作用的必經步驟。 OCNP在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌胞外和胞內可能存在多種作用位點。通過對細菌表面疏水性的分析，隨著OCNP濃度的增高，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的表面疏水性明顯下降。OCNP對菌體膜蛋白熒光光譜的影響表明，納米球會導致菌體細

9、胞膜結構發(fā)生變化，改變膜蛋白的空間構象。SDS-PAGE顯示OCNP對大腸桿菌外膜蛋白具有很強的結合能力，外膜蛋白有可能是OCNP在大腸桿菌表面的結合位點。通過卵磷脂對OCNP抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的研究，揭示了磷脂在OCNP與金黃色葡萄球菌菌體細胞膜相互作用中是結合位點，與OCNP表面的自由氨基發(fā)生反應，改變菌體細胞膜通透性，導致細菌死亡。在進一步考察磷酸基團對OCNP抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的影響時，證明了磷脂中的

10、磷酸基團是OCNP與金黃色葡萄球菌相互作用時的結合位點。熒光顯微鏡觀察的結果表明異硫氰酸熒光素(FITC)標記的FITC-OCS納米球進入細菌的方式因菌種而異。對于金黃色葡萄球菌，FITC-OCS納米球能夠在較短的時間內透過細胞壁和細胞膜，進入菌體內部；而對于大腸桿菌，FITC-OCS納米球在菌體表面滯留15 min后才能進入菌體內部。采用凝膠阻滯的方法驗證了OCNP在離體條件下與菌體DNA/RNA的直接相互作用，推測核酸是OCNP在胞