VIP及受體VIPR2在小鼠正常屈光發(fā)育及形覺(jué)剝奪近視中的作用研究.pdf

1、本文對(duì)VIP及受體VIPR2在小鼠正常屈光發(fā)育及形覺(jué)剝奪近視中的作用進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分 VIP和VIPR2與近視的相關(guān)性驗(yàn)證研究。
　　目的：通過(guò)對(duì)形覺(jué)剝奪性近視小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一個(gè)差異基因-血管活性腸肽（VIP）可能與近視有關(guān)，另外通過(guò)Meta關(guān)聯(lián)分析在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)VIP的受體-VIPR2可能為高度近視的易感基因。本研究部分將進(jìn)一步明確VIP及受體VIPR2在眼球中的表達(dá)分布以及

2、在近視進(jìn)展中發(fā)揮作用的時(shí)間點(diǎn)和可能的作用部位。并進(jìn)一步通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證 VIP受體（VIPR1、VIPR2）是否為病理性近視的易感基因。
　　方法：將21日齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分組后進(jìn)行短期（1d、2d）和中長(zhǎng)期（1W、2W和4W）剝奪處理。3周齡 C57BL/6J小鼠正常小鼠眼球取材，逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）檢測(cè)VIP和VIPR2在小鼠眼各組織表達(dá)；小鼠形覺(jué)剝奪處理完成后取視網(wǎng)膜和鞏膜，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（

3、quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR）檢測(cè)視網(wǎng)膜和鞏膜中VIP和VIPR2 mRNA表達(dá)水平變化；通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)VIPR1、VIPR2的SNPs是否與病理性近視相關(guān)。
　　結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VIP在小鼠視網(wǎng)膜中高表達(dá)，在脈絡(luò)膜及RPE、角膜和鞏膜也有表達(dá)，而在虹膜和晶狀體未見(jiàn)表達(dá)；VIPR2在所取的眼球各組織均廣泛表達(dá)。短期形覺(jué)剝奪（1d、2d），剝奪眼相比對(duì)側(cè)眼和正常對(duì)照眼

4、，視網(wǎng)膜中VIP mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（FD-1d,P＜0.05; FD-2d,P＜0.001）；而剝奪眼視網(wǎng)膜VIPR2 mRNA水平表達(dá)相比對(duì)側(cè)眼和正常對(duì)照眼均明顯增加（P＜0.05）。在中長(zhǎng)期形覺(jué)剝奪（1W、2W、4W）時(shí)，剝奪眼相比對(duì)側(cè)眼和正常對(duì)照眼視網(wǎng)膜中VIP、VIPR2表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。無(wú)論短期還是中長(zhǎng)期剝奪，鞏膜中VIP、VIPR2在各眼中的表達(dá)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)VIPR1、VIPR2進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和獨(dú)立重復(fù)

5、樣本驗(yàn)證， Meta分析發(fā)現(xiàn) VIPR2基因 SNP（ rs6979985）具顯著性差異（P=5.64×10-8），未發(fā)現(xiàn)VIPR1上的SNP有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：VIP和VIPR2在小鼠眼組織均有表達(dá)，VIPR2表達(dá)更為廣泛。VIP和VIPR2在形覺(jué)剝奪早期明顯變化，表明VIP和VIPR2可能參與而且是在早期參與近視的調(diào)控，由于鞏膜中的VIP和VIPR2均未發(fā)現(xiàn)變化，推測(cè)可能是視網(wǎng)膜而不是鞏膜中的VIP參與并通過(guò)VIPR2參

6、與近視調(diào)控進(jìn)程。通過(guò)關(guān)聯(lián)分析明確VIPR2基因 SNP(rs6979985)與病理性近視相關(guān)，表明 VIPR2可能為病理性近視的一個(gè)易感基因，而VIPR1可能不是病理性近視的一個(gè)易感基因。
　　第二部分：動(dòng)物藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)明確VIPR2是否影響近視形成。
　　目的：第一部分初步明確VIP和VIPR2與近視有關(guān)，但兩者之間因果關(guān)系并未明確。本部分研究將通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)（VIPR2拮抗劑和激動(dòng)劑）明確VIPR2功能異常是否影響正常屈光

7、發(fā)育和形覺(jué)剝奪性近視的進(jìn)展，初步闡明VIPR2在正常屈光發(fā)育和FDM中的作用。
　　方法：將21日齡的C57BL/6J小鼠隨機(jī)實(shí)驗(yàn)組和溶劑對(duì)照組。正常屈光發(fā)育實(shí)驗(yàn)分成VIPR2拮抗劑組（PG99-465, n=21）和溶劑組（DMSO, n=18），PG99-465按3 mg/kg·d劑量腹腔注射給藥4周；形覺(jué)剝奪實(shí)驗(yàn)分成形覺(jué)剝奪+VIPR2激動(dòng)劑組（Ro25-1553, n=17）和形覺(jué)剝奪+溶劑組（DMSO, n=22），Ro

8、25-1553按0.3 mg/kg·d劑量腹腔注射給藥4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)屈光和眼軸等生物學(xué)參數(shù)。結(jié)果：VIPR2拮抗劑（PG99-465）注射2周和4周后，PG99-465給藥組相對(duì)溶劑組（DMSO）明顯向近視漂移，2周平均漂移約-3.75 D（P＜0.01），4周約-4.77 D（P＜0.01）。玻璃體腔深度相對(duì)變長(zhǎng)，但只在給藥4周時(shí)左眼具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；前房深度相對(duì)變短，在給藥2周時(shí)左眼，給藥4周時(shí)左右眼具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

9、（P＜0.001）；而眼軸卻相對(duì)略有變短趨勢(shì)，給藥2周左眼具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其它生物學(xué)參數(shù)無(wú)顯著性差異。形覺(jué)剝奪+VIPR2激動(dòng)劑（Ro25-1553）給藥4周后發(fā)現(xiàn)Ro25-1553與溶劑組比較可明顯抑制FDM進(jìn)展（-1.77 D，P＜0.05），形覺(jué)剝奪后剝奪眼相比對(duì)側(cè)眼，玻璃體腔和眼軸等發(fā)生相應(yīng)的延長(zhǎng)（玻璃體腔P＜0.001；眼軸P＜0.05）。
　　結(jié)論：注射VIPR2拮抗劑PG99-465）可誘導(dǎo)出相對(duì)性近視

10、，而給予VIPR2激動(dòng)劑（Ro25-1553）可抑制形覺(jué)剝奪性近視（FDM）的形成，表明VIPR2參與并影響正常屈光發(fā)育和FDM的形成。
　　第三部分：VIPR2基因全身敲除小鼠對(duì)屈光發(fā)育的影響。
　　目的：由于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)藥物存在特異性不足，進(jìn)一步利用VIPR2基因敲除小鼠，明確VIPR2是否為近視形成的原因，并初步探討其分子致病機(jī)制。
　　方法：利用CRISPR-Cas9技術(shù)，構(gòu)建VIPR2全身基因敲除小鼠，在4周、

11、5周、6周、8周、10周及12周齡時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)屈光及眼軸等生物學(xué)參數(shù)，檢測(cè)VIPR2是否影響屈光發(fā)育。在不同的時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行視網(wǎng)膜電生理、眼底、血管造影、眼前節(jié)檢查及眼組織形態(tài)學(xué)觀察，明確VIPR2對(duì)視網(wǎng)膜及視覺(jué)功能的影響。
　　結(jié)果：VIPR2全身敲除小鼠相比野生型同窩仔，屈光明顯向近視方向漂移，整體平均漂移約-3.24 D，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，bonferroni校正，P＜0.05），并且在不同的時(shí)間點(diǎn)

12、（4W、5 W、8 W、10 W）均具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（多變量方差分析，P＜0.05）。7W電生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在暗適應(yīng)條件下，VIPR2-KO小鼠的a波和b波振幅相對(duì)野生型明顯升高；而振蕩電位（OPs）振幅在-25 dB刺激強(qiáng)度時(shí)，VIPR2-KO小鼠OP1明顯升高（P＜0.05）；在-10 dB時(shí)，VIPR2-KO小鼠OP1、OP2明顯升高（P＜0.05）。眼底照相及熒光血管造影、眼前節(jié)和組織形態(tài)學(xué)檢查并無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：VIPR2