新生兒缺氧缺血性腦病大鼠模型實驗基礎及臨床研究.pdf

1、第一部分、超聲技術評價新生大鼠缺氧缺血性腦病模型的實驗研究
　　目的：新生兒缺氧缺血性腦病(neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy，NHIE)是新生兒在胎兒期和出生后因為窒息缺氧原因所引起的顱腦損傷，包含出生前胎兒在宮內的窘迫以及生后缺氧兩方面原因，是導致新生兒死亡和嬰幼兒神經系統(tǒng)功能產生后遺癥的主要原因，NHIE的病因十分復雜，并且病變的程度、病變開始的時間很難及時進行辨別，因此需要進行

2、及時的NHIE早期診斷，有助于患兒的早期恢復，以期改善遠期預后和減少殘疾。本研究通過建立新生大鼠NHIE模型，應用二維超聲(two-dimensionalultrasound，2DUS)觀察側腦室、腦實質的聲像圖改變，和多普勒超聲動態(tài)監(jiān)測大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）血流參數(shù)在整個腦缺氧缺血過程中的改變程度，還應用聲輻射力脈沖成像(acoustic radiation forceimpulse ima

3、ging，ARFI)技術評價新生大鼠模型NHIE腦損傷的組織硬度，并與腦組織病理改變進行對比研究，同時對實驗大鼠進行神經行為學的檢測評分，探討超聲各項指標與新生大鼠不同程度NHIE模型的病理組織學改變及神經行為學改變之間的關系。
　　方法：
　　1.制作動物模型:選用廣西醫(yī)科大學實驗動物中心7日齡的Wistar大鼠108只，分成假手術組和兩個建模組。假手術組36只:僅使用眼科器械切開皮膚，鈍性分離大鼠幼崽右側頸總動脈，不予以

4、結扎，再直接進行皮膚縫合。模型組1:缺血組36只，直接用絲線結扎右側頸總動脈，縫合傷口;模型組2:缺氧缺血組36只，用絲線結扎右側頸總動脈，之后放回母鼠身邊進行2h的恢復，再將動物模型放入8％的氧和氮氣混合氣體的缺氧箱中，持續(xù)缺氧2h后取出放回母鼠籠中飼養(yǎng)。
　　2.超聲檢查動物模型:三組實驗大鼠分別于術后3、12、24、48、72h進行超聲檢查。將大鼠的頭顱固定于超聲檢查操作臺上，探頭置于頭部頂骨中線，用2DUS觀察其側腦室、腦

5、實質的病變。應用彩色多普勒超聲(ColorDoppler flow imaging，CDFI)和脈沖多普勒(pulsed wave Doppler，PW)技術測定雙側MCA起始端的收縮期最大血流速度（systoli velocity，Vs）、舒張期末最大血流速度（diastolic velocity，Vd）及阻力指數(shù)(resistance index，RI)。并應用ARFI技術測量實驗大鼠腦組織內部剪切波速度(shear wavevel

6、ocity，SWV)。
　　3.動物模型的腦組織病理學檢查:每組隨機選取12只大鼠進行病理組織標本的制作及腦組織病理改變的觀察。使用HE染色觀察雙側腦組織水腫范圍、神經細胞、膠質細胞狀態(tài)，以及腦組織的出血位置和范圍。
　　4.動物模型的神經行為學觀察:將每組剩余的大鼠幼崽飼養(yǎng)至出生后30天進行神經行為學觀察。
　　結果：
　　1.動物模型制模成功率:缺血組在建模過程中有4只大鼠死亡，死亡率為11.11％(4/36

7、)，建模成功率為88.89％(32/36)。缺氧缺血組在建模過程中共有6只大鼠死亡，死亡率為16.67％(6/36)，建模成功率為83.33％(30/36)。假手術組:建模過程中無大鼠死亡，建模成功率為100.00％(36/36)。
　　2.動物模型PW檢查結果:三組大鼠模型術前MCA的血流動力學參數(shù)Vs、Vd及RI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。缺血組手術側MCA的Vs術前為10.62±1.28，與術后3h下降至6.80

8、±1.62相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后12h、24h、48h與其前一時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，術后72h為6.15±1.51，與術后48h的7.29±1.51相比下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);手術側MCA的Vd術前為3.17±0.69，與術后3h下降至3.00±0.46相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，于術后12h上升至3.44±0.65，與術后3h相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05

9、），術后24h、48h、72h數(shù)值與其前一時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);手術側MCA的RI術前為0.69±0.05，與術后12h下降至0.52±0.07相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后24h、48h數(shù)值與其前一時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，于術后72h下降至0.48±0.10，與其前一時間點相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。缺氧缺血組手術側MCA的Vs術前為10.77±1.30，與術后1

10、2h下降至5.97±0.60相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后24h、48h、72h數(shù)值與其前一時間點相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);手術側MCA的Vd術前為3.20±0.77，與術后3h上升至4.20±0.97相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，于術后12h下降至3.31±0.75，與術后3h數(shù)值相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后24h、48h、72h數(shù)值與其前一時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.0

11、5);手術側MCA的RI術前為0.71±0.03，與術后3h下降至0.40±0.05相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后12h數(shù)值為0.45±0.64，與術后3h數(shù)值相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后24h、48h數(shù)值與其前一時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），術后72h數(shù)值為0.47±0.06，與術后48h的0.42±0.08相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);總而言之，與缺血組對比，缺氧缺血組術后各時

12、間點的RI值均更低下，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.動物模型術前、術后的腦組織SWV值:假手術組術后各時間點SWV值與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。缺血組大鼠腦組織SWV值術前為0.86±0.22，與術后3h上升至1.34±0.12相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），術后12h、24h數(shù)值與其前一時間點相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，術后48h上升至1.41±0.12，與術后24h相比，差異

13、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后72h與48h數(shù)值相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。缺氧缺血組大鼠腦組織SWV值術前為0.83±0.20，與術后3h的1.61±0.08相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后12h與3h數(shù)值相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，術后24h、48h數(shù)值與其前一時間點相比均上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后72h為1.64±0.18與術后48h的1.76±0.15相比，差異有統(tǒng)計學意

14、義(P＜0.05)?？偠灾?，缺氧缺血組術后各時間點SWV值與缺血組相比均更高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.動物模型腦組織HE染色病理改變:假手術組腦組織分層結構清晰，皮質和髓質的邊界清楚;神經元細胞核可見清楚的核仁、豐富的細胞質和Nissl氏體。缺血組腦組織的分層結構尚清晰，可以確定皮質和髓質邊界;神經元細胞核偶可見核破裂，血管周圍腦細胞出現(xiàn)水腫。缺氧缺血組腦組織的分層結構較不明顯，皮質和髓質的邊界不清楚;神經元

15、細胞核偶可見核染色加深，細胞核不清楚，Nissl體較少，在小血管中可見大量紅細胞的積聚。
　　5.動物模型神經學測試統(tǒng)計結果:缺血組與缺氧缺血組的神經行為學測試評分與假手術組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）:曠場試驗缺血組與缺氧缺血組水平得分及垂直得分均降低（水平得分:缺血組49.81±8.00，缺氧缺血組32.00±5.29，假手術組63.30±11.60;垂直得分:缺血組9.75±2.08，缺氧缺血組7.21±1.67

16、，假手術組13.50±3.0），差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.05);懸吊試驗缺血組及缺氧缺血組大鼠在玻璃棒上停留時間均小于假手術組（缺血組1.38±0.62分鐘，缺氧缺血組0.79±0.70分鐘，假手術組2.05±0.76分鐘），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);斜坡實驗缺血組及缺氧缺血組大鼠頭部從朝下45度變?yōu)橄蛏洗笥?35度的時間均顯著慢于假手術組（缺血組4.00±0.73秒，缺氧缺血組7.79±1.63秒，假手術組2.80±0.8

17、3秒），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;拒俘反應實驗得分缺血組及缺氧缺血組均大于假手術組(缺血組3.81±0.75，缺氧缺血組4.85±0.75，假手術組2.36±0.93)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？偠灾?，神經行為學表現(xiàn)由好到差排列為:假手術組＞缺血組＞缺氧缺血組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.新生大鼠采取單側頸總動脈結扎并聯(lián)合放置缺氧箱的方法制作NHIE模型是模擬人類NHIE的可靠

18、方式。
　　2.新生大鼠模型腦內血流動力學參數(shù)的改變可反映出NHIE早期病變，并與病變程度相對應，NHIE可導致腦組織層次結構改變、神經元數(shù)目減少、神經細胞腫脹變形、出血梗死等病理變化。
　　3.ARFI技術可定量的反映出新生大鼠模型NHIE腦組織的硬度，可準確評估腦損傷程度，其操作簡單、安全系數(shù)高、對組織影響小。
　　4.本組新生大鼠模型可觀察到NHIE引起的神經行為學預后不良后果，通過神經行為學試驗可評估其損傷程度

19、，并為臨床提供腦損傷后顱腦病變的基礎研究數(shù)據(jù)。
　　第二部分、超聲技術及格塞爾發(fā)育診斷量表評價新生兒缺氧缺血性腦病的臨床研究
　　目的：NHIE可能導致嬰兒死亡率升高以及遠期不良疾病的發(fā)生。重度NHIE可導致嚴重神經系統(tǒng)后遺癥，對于患兒的遠期不良影響主要包括智力和運動發(fā)育受損、皮質盲、神經性聽力損失、智力殘疾、腦性麻痹、癲癇和腦癱，嚴重者甚至死亡。ARFI技術可直觀得到組織硬度特性的信息，與物理觸診相似，具有較廣闊的臨床應用

20、前景，并可幾乎適用于人體所有器官。本研究應用超聲CDFI和PW檢測新生兒NHIE病例的MCA血流動力學參數(shù)，并使用ARFI技術評價腦損傷情況，并進行超聲隨訪，與患兒格塞爾發(fā)育診斷量表(Gesell Development Diagnosis Scale，GDDS)結果進行對比，為臨床早期診斷NHIE和評估預后提供基礎研究的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.應用超聲檢查技術動態(tài)觀察臨床確診NHIE患兒204例，首次檢查時間為出生

21、后3天內，患兒均無合并先天性心臟病。正常對照組200例。
　　2.觀察指標:應用2DUS觀察雙側腦室及腦實質的回聲狀態(tài)。應用彩色多普勒超聲從側囟顯示MCA起始端，運用PW技術獲取Vs、Vd及RI參數(shù)，14天后及1個月后分別返院行顱腦超聲復查。使用ARFI技術獲得左、右側頂葉白質區(qū)、大腦鐮部位及雙側丘腦SWV值。共有131例患兒（足月兒輕度組32例，足月兒中重度組35例，早產兒輕度組34例，早產兒中重度組30例）于出生后4周至8周內

22、行第一次GDDS測試，并且10個月后及20個月均行GDDS復查，以發(fā)育商數(shù)(development quotient，DQ)記錄智力測試評分。
　　結果：
　　1.2DUS檢查結果:輕度組表現(xiàn)為局限于側腦室旁的腦實質回聲增強聲像，與脈絡叢比較回聲低，14天后回聲恢復正常;并室管膜下出血28例，腦室內出血15例。中重度組表現(xiàn)為腦實質彌漫性的回聲增高，回聲可略低于或等同于脈絡叢，14天后復查腦實質回聲72例恢復正常，24例顯示側

23、腦室擴張聲像，6例腦實質內探及無回聲囊腔形成;并室管膜下出血34例，腦室內出血20例，腦實質出血4例。
　　2.CDFI及PW檢查結果:出生后3天內檢測MCA的血流參數(shù)，足月兒輕度組、中重度組Vs較對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);輕度組、中重度組Vd與對照組相比具有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);三組RI比較均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。早產兒組輕度組、中重度組Vs與對照組相比下降，差異有統(tǒng)計學意

24、義(P＜0.05);輕度組、中重度組Vd與對照組相比下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;三組RI比較均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。通過繪制RI散點圖發(fā)現(xiàn)，足月兒中重度組RI多集中于＜0.65和＞0.75兩個范圍，早產兒中重度組RI多集中于＜0.60和＞0.80兩個范圍。14天后及1個月后復查各組大部分患兒血流動力學參數(shù)趨于好轉，即Vs上升，Vd上升。通過繪制各組復診時的RI散點圖顯示出14天復診時足月兒中重度組RI多集中于0.

25、70至0.80范圍，早產兒中重度組RI多集中于0.60至0.80范圍;1個月復診時足月兒中重度組RI多集中于0.65至0.75范圍，早產兒中重度組RI多集中于0.65至0.80范圍。
　　3.ARFI檢查結果:由于接受檢查患兒例數(shù)較少（共137例，其中輕度組40例、中重度度組42例和對照組55例），因此足月兒與早產兒合并分析結果。出生3天內使用ARFI技術檢測腦組織各部位SWV值結果顯示輕度組、中重度組及對照組各組內顱腦頂葉、丘腦

26、SWV值左、右比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。經組間兩兩比較，中重度組頂葉、丘腦SWV值高于輕度組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），輕度組丘腦SWV值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。其中有72例NHIE患兒（輕度組34例，中重度組38例）遵醫(yī)囑在初診14天后及1個月后分別兩次返院進行ARFI復診測量，每次復診均再次進行腦組織各部位SWV值的測量。結果顯示輕度組及中重度組兩次復查頂葉SWV值逐漸下降，差異有

27、統(tǒng)計學意義(P＜0.05);雙側丘腦來兩次復查SWV值與初診比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。輕度組及中重度組大腦鐮SWV數(shù)值兩次復查與初診相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.NHIE患兒GDDS及神經系統(tǒng)預后結果:行初次超聲檢查之后，早產兒輕度組有1例患兒因合并重癥肺炎及敗血癥而死亡，足月兒中重度組有1例患兒因合并腎功能不全死亡，早產兒中重度組有2例患兒因NHIE死亡，各組間患兒死亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(

28、P＞0.05)。經過10個月及20個月患兒的發(fā)育及康復訓練等治療措施后，各組各項GDDS兩次復診與初診相比DQ評分均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各組神經系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，20個月的DQ分數(shù)顯示，足月兒輕度組＞早產兒輕度組＞足月兒中重度組＞早產兒中重度組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.超聲CDFI及PW檢測MCA血流動力學參數(shù)能在一定程度上反映出NHI