淫羊藿苷對(duì)炎癥細(xì)胞遷移粘附和血管重構(gòu)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文分析了淫羊藿苷對(duì)炎癥細(xì)胞遷移粘附和血管重構(gòu)的影響。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：淫羊藿苷改善野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型小鼠血管重構(gòu)。
　　目的：觀察淫羊藿苷（Icariin，ICA）對(duì)野百合堿（MCT）所致的CX3CL1-/-小鼠及野生型小鼠肺動(dòng)脈高壓（PAH）模型的血管重構(gòu)的影響，分析ICA抗PAH效應(yīng)與CX3CL1的關(guān)系。
　　方法：雄性野生型和CX3CL1-/-小鼠各28只，均隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型

2、組、ICA組（60 mg/kg）、ICA組（120 mg/kg）。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，除空白組外均經(jīng)頸背部一次性皮下注射MCT（70 mg/kg）建立PAH模型，造模后第7天按分組灌胃給藥，空白對(duì)照組及模型組給予等量雙蒸水，每天一次，連續(xù)21 d。給藥21 d后采用B超檢測(cè)PAH模型小鼠的左室短軸縮短率（FS）、心臟射血分?jǐn)?shù)（EF）、舒張末期的右室內(nèi)徑（RVID;d）、左室質(zhì)量（LV Mass）、左室舒張末期容積（LV Vol;d

3、）、左室收縮末期容積（LV Vol;s）、每搏輸出量（Stroke Volume）；記錄小鼠的死亡率；HE染色觀察肺小動(dòng)脈病理學(xué)變化；測(cè)定右室重量、左室+室間隔重量并計(jì)算右心室肥大指數(shù)（RVHI=RV/LV+S）；免疫熒光法觀察肺小動(dòng)脈炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)情況。
　　結(jié)果：CX3CL1-/-小鼠：與空白對(duì)照組比較，模型組中FS、EF、Stroke Volume下降（P<0.05或P<0.01），RVID;d、LV Mass、LV Vol;

4、s顯著升高（P<0.05或P<0.01）， LV Vol;d無(wú)明顯變化；RVHI增大（P<0.05）；死亡率為12.5％；肺小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。與模型組比較， ICA給藥組FS、EF明顯升高（P<0.01），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s顯著下降（P<0.05或P<0.01），LV Vol;d、Stroke Volume無(wú)明顯變化；RVHI無(wú)差異；ICA組（60 mg/kg）死亡率為12.5%、ICA

5、組（120 mg/kg）無(wú)死亡；肺小動(dòng)脈管壁增厚減輕，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)減少。野生型小鼠：與空白對(duì)照組比較，模型組中FS、EF顯著下降（P<0.01）， RVID;d、LV Mass、LV Vol;d、LV Vol;s、Stroke Volume顯著升高（P<0.01）；RVHI顯著升高（P<0.01）；死亡率為42.82%。肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。與模型組比較，ICA給藥組FS、EF、Stroke Volume明顯

6、升高（P<0.01或P<0.05），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s明顯下降（P<0.01或P<0.05）， LV Vol;d無(wú)明顯變化；RVHI減輕（P<0.05）；ICA組（60 mg/kg）死亡率為28.57%、ICA組（120 mg/kg）死亡率為14.29%，肺小動(dòng)脈管壁變薄，管腔增寬，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)減少。CX3CL1-/-小鼠與野生型小鼠比較：與空白對(duì)照組比較，模型組中CX3CL1-/-小鼠FS、EF、LV Vo

7、l;d、Stroke Volume高于野生型小鼠，CX3CL1-/-小鼠RVID;d、LV Mass、LV Vol;s低于野生型小鼠，其中FS、EF、LV Vol;d、Stroke Volume（P<0.01或P<0.05），CX3CL1-/-小鼠肺小動(dòng)脈管壁厚度、管腔大小、炎癥細(xì)胞量低于野生型小鼠；ICA組CX3CL1-/-小鼠FS、EF、LV Vol;d、LV Vol;s、Stroke Volume高于野生型小鼠，RVID;d、LV

8、 Mass低于野生型小鼠，其中ICA組（60 mg/kg） Stroke Volume（P<0.05），ICA組（120 mg/kg）LV Mass（P<0.01），CX3CL1-/-小鼠肺小動(dòng)脈管壁厚度、管腔大小、炎癥細(xì)胞量低于野生型小鼠，且ICA組（120 mg/kg）效果高于ICA組（60 mg/kg）。
　　結(jié)論：ICA可改善MCT誘導(dǎo)的PAH模型小鼠的血流動(dòng)力學(xué)和肺血管重構(gòu)，ICA對(duì)CX3CL1-/-小鼠PAH模型的改善

9、作用較野生型小鼠差。
　　第二部分：淫羊藿苷通過(guò)下調(diào)NF-κB/CX3CL1抑制TNF-α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞向人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附。
　　目的：研究淫羊藿苷（icariin，ICA）對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞（THP-1）向人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）遷移和黏附的影響及其機(jī)制。
　　方法：⑴免疫熒光染色鑒定CX3CL1、CX3CR1蛋白分別在HUVECs和THP-1表達(dá)情況。⑵采用Transwells聯(lián)合培養(yǎng)TH

10、P-1（上室）和HUVECs（下室），分為對(duì)照組(control)、模型組(TNF-α)、ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）組和DMSO(溶媒對(duì)照，0.1%)組，TNF-α誘導(dǎo)THP-1向HUVECs遷移和黏附，ICA預(yù)給藥4h后加入TNF-α(10 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24h，移除Transwells，并對(duì)培養(yǎng)液中的THP-1計(jì)數(shù)，即為遷移細(xì)胞數(shù)；免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)THP-1向HUVECs黏附的情況；ELISA檢測(cè)HU

11、VECs膜結(jié)合型CX3CL1（mCX3CL1）、培養(yǎng)基中溶解型CX3CL1（sCX3CL1）蛋白量；Western blot檢測(cè)HUVECs中CX3CL1、THP-1中CX3CR1、IκB-α、P-NF-κB(p65)蛋白量。⑶選用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）為陽(yáng)性對(duì)照，分析 ICA抑制 THP-1遷移黏附作用與NF-κB/CX3CL1信號(hào)通路的關(guān)系。將Transwells聯(lián)合培養(yǎng)的THP-1（上室）和HUVECs（下

12、室）分為對(duì)照組(control)、模型組（TNF-α)、ICA10-6 mol/L組、PDTC（50μmol/L）組，ICA和PDTC預(yù)給藥4h后加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24h；THP-1遷移黏附及sCX3CL1和mCX3CL1蛋白量檢測(cè)方法同上；免疫熒光檢測(cè)NF-κB核轉(zhuǎn)錄情況；Western blot檢測(cè)IκB-α、P-NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)。⑷為了進(jìn)一步證實(shí)ICA抑制THP-1遷移和黏附與CX3CL1的關(guān)系，采用Transw

13、ells聯(lián)合培養(yǎng)THP-1和HUVECs，CX3CL1誘導(dǎo)THP-1向HUVECs遷移和黏附，并觀察ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）對(duì)該模型的影響。ICA預(yù)給藥4h后加入CX3CL1(50 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24h， THP-1遷移黏附檢測(cè)方法同上；Western blot檢測(cè)CX3CR1、P-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平。
　　結(jié)果：HUVECs和THP-1有CX3CL1、CX3CR1蛋白表達(dá)。與對(duì)

14、照組比較，TNF-α(10 ng/mL)能夠誘導(dǎo) THP-1向 HUVECs的遷移和黏附、提高 sCX3CL1、mCX3CL1、CX3CL1和CX3CR1的蛋白水平，激活NF-κB。ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）能抑制TNF-α刺激的THP-1向HUVECs遷移和黏附(P＜0.01或P＜0.05），降低sCX3CL1、mCX3CL1、CX3CL1和CX3CR1蛋白水平(P＜0.01或P＜0.05），抑制NF-κB p

15、65的磷酸化水平和阻斷IκB蛋白的降解(P＜0.01或P＜0.05）。PDTC也能起到與ICA同樣的作用，ICA的效果稍高于PDTC。此外，與對(duì)照組比較，CX3CL1誘導(dǎo)THP-1向HUVECs遷移和黏附的數(shù)量明顯增多(P＜0.01），伴有CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平升高（P＜0.05）；ICA預(yù)處理（10-8～10-6 mol/L）能減少THP-1向HUVECs遷移和黏附的數(shù)量（P＜0.05或 P＜0.01