高壓氧對小鼠缺血再灌注腎組織自噬的影響及其腎保護機制的研究.pdf

1、目的：
　　通過建立小鼠腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)模型，觀察自噬誘導和非誘導狀態(tài)下腎IRI中腎組織病理學、超微結構、腎功能、自噬基因及自噬相關蛋白表達量的變化，以及高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)治療對其表達的影響。探討腎IRI中自噬的發(fā)生發(fā)展、信號轉導及其對腎功能等的影響，進一步闡明自噬在腎IRI中的作用以及HBO治療對自噬的影響。
　　

2、方法：
　　將C57BL/6小鼠隨機分為非自噬誘導組（非雷帕霉素處理）和自噬誘導組（雷帕霉素預處理）兩個大組。每組又分為正常對照組、假手術組、腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IRI組、腎IRI+HBO組,然后再將假手術組、腎IRI組及腎IRI+HBO組分為1h、3h、6h、12h、24h組，每組6只小鼠。其中，自噬誘導組所有小鼠均于腎缺血和腎IRI模型建立前1h行雷帕霉素預處理。正常對照組僅切開腹腔后立即切取雙腎及采血。假手術組切開

3、腹腔，雙側腎蒂不阻斷，分別在1h、3h、6h、12h、24h時切取雙腎并采取靜脈血。腎缺血組為切開腹腔后，雙側腎蒂阻斷45min，后切取雙腎并采取靜脈血。HBO+腎缺血組為小鼠經HBO預處理1h后切開腹腔，雙側腎蒂阻斷45min，切取雙腎并采靜脈血。腎IRI組為切開腹腔，雙側腎蒂阻斷45min后開放血流，分別于再灌注后1h、3h、6h、12h、24h切取雙腎并采取靜脈血。腎IRI+HBO組為切開腹腔，雙側腎蒂阻斷45min后開放血流，分

4、別于再灌注后0h、2h、5h、11h、23h時行HBO治療，HBO治療1h后切取雙腎并采取靜脈血。采用HE染色觀察腎組織的病理改變，透射電鏡觀察細胞超微結構及檢測自噬體，免疫組化法檢測Beclin-1、LC3-II、Atg-4、PKC及PI3K-III蛋白的表達，Western blot檢測LC3-II蛋白的表達以及全自動生化分析儀檢測血清肌酐(SCr)。
　　結果：
　　1.腎功能變化
　?。?）在非雷帕霉素和雷帕霉

5、素組均可見假手術組SCr值與正常對照組無顯著差異；腎缺血組SCr值顯著高于正常對照組和假手術組（P<0.01）；HBO+腎缺血組SCr值顯著低于腎缺血組（P<0.05），但顯著高于正常對照組和假手術組（P<0.01）；腎IRI組SCr值各時間點顯著高于腎缺血組、正常對照組和假手術組（P<0.01）；腎IRI+HBO組SCr值各時間點顯著高于正常對照組和假手術組（P<0.01），腎IRI+HBO組SCr值于1h、3h、6h顯著低于腎IRI

6、組（P<0.01）；腎IRI組內和腎IRI+HBO組內各時間點SCr值有顯著差異（P<0.05），且隨著時間延長，SCr值逐漸增加，于24h達最高。
　　（2）在非雷帕霉素和雷帕霉素組組之間：非雷帕霉素腎IRI組和腎IRI+HBO組于1h、3h、6h、12h時SCr值顯著低于雷帕霉素組（P<0.05），其余雷帕霉素組的各組SCr值與非雷帕霉素組無顯著差異。
　　2.腎組織病理變化
　　非雷帕霉素和雷帕霉素組均可見正常對

7、照組和假手術組各時間點腎組織結構正常。腎缺血組見腎小管間質輕度出血，腎小球毛細血管攀輕度淤血，腎小管輕度腫脹。自噬誘導后，腎小管間質出血及腎小球毛細血管攀淤血明顯，可見少量腎小管上皮細胞壞死脫落碎片。經HBO預處理后腎小球及腎小管間質未見明顯出血，余與腎缺血組鏡下觀察無顯著差別。腎IRI組1h、3h可見腎小管腫脹，部分腎小管管腔消失，腎小管管腔內可見少量上皮細胞壞死脫落碎片，胞漿顆粒樣變性，腎小管間質出血，隨著時間延長病變逐漸加重，12

8、h時可見部分腎小管上皮細胞壞死脫落，24h時可見大片狀腎小管上皮細胞壞死脫落，同時可見大量的紅細胞管型，皮髓交界處最明顯。自噬誘導后，可見大片腎小管上皮細胞壞死脫落，蛋白管型增多。經HBO治療后腎小管細胞腫脹和間質出血以1h最明顯，3h、6h病變較腎IRI組減輕，出血隨著時間延長逐漸減輕，12h、24h時腎小管上皮細胞壞死和腎小球毛細血管攀淤血較腎IRI同時間點減輕，但腎小管間質出血較腎IRI對應時間點重，出血以髓質明顯，腎小球囊腔可見

9、纖維素樣物質滲出，紅細胞管型較少。
　　3.透射電鏡觀察自噬體的變化
　　在非雷帕霉素和雷帕霉素組均可見正常對照組和假手術組各時間點腎組織結構正常，其間偶可見少量自噬體形成。腎缺血性損傷后可見部分線粒體稍腫脹，膜結構不清晰，自噬體數(shù)量較正常對照組和假手術組增多，余鏡下觀察與正常對照組和假手術組無顯著差別。自噬誘導后，病變鏡下觀察無差別，自噬體數(shù)量增多，經HBO預處理后，自噬體數(shù)量進一步增加。腎IRI組可見大量的自噬泡和自噬體

10、形成，雙層膜結構的自噬體明顯，自噬體包裹的線粒體及蛋白質清晰可見，可見脂肪變性的脂滴形成，6h組可見自噬體最多，腎小管上皮細胞微絨毛失去膜型結構，但輪廓尚可辨，線粒體稍腫脹，溶酶體少見。12h和24h時自噬體逐漸減少，腎小管上皮細胞游離面微絨毛逐漸消失，線粒體腫脹，部分嵴斷裂，可見少量次級溶酶體，腎小管基底膜不清晰，核膜出現(xiàn)皺褶且不清晰，病變以24h最顯著。自噬誘導后，對應時間點自噬體數(shù)量增加，病變加重。經HBO治療后自噬體數(shù)量進一步增

11、加，12h和24h時自噬體仍較多，但病變減輕，病變仍以24h顯著。
　　4.免疫組化法檢測腎組織Beclin-1、LC3-II、PI3K-III、PKC以及Atg-4的表達變化：
　?。?）Beclin-1：主要表達于腎小管上皮細胞胞漿，少量表達于腎小球。相對定量結果顯示：
　　①在非雷帕霉素和雷帕霉素組均可見正常對照組、假手術組及腎缺血組之間Beclin-1蛋白表達量無顯著差異，HBO+腎缺血組Beclin-1蛋白表

12、達量顯著低于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.01）。在非雷帕霉素腎IRI組于6h、12h時Beclin-1蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組及腎缺血組，而在雷帕霉素腎IRI組于1h、3h、6h時Beclin-1蛋白表達量高于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.01）。在非雷帕霉素腎IRI+HBO組于1h、3h時Beclin-1蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組及腎IRI組（P<0.01），于12h、24h時Becli

13、n-1蛋白表達量顯著低于腎IRI組（P<0.01）。雷帕霉素腎IRI+HBO組于1h、24h時Beclin-1蛋白表達量顯著低于正常對照組、假手術組，6h時顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01），腎IRI+HBO組于1h、3h、6h時Beclin-1蛋白表達量顯著低于腎IRI組（P<0.01）。在非雷帕霉素和雷帕霉素假手術組內各時間點Beclin-1蛋白表達量無顯著差異，腎IRI組內和腎IRI+HBO組組內3h、6h、12h、24

14、h時Beclin-1蛋白表達量均有顯著差異（P<0.01），且隨著時間的延長，Beclin-1蛋白表達量逐漸升高，于6h達最高，后隨著時間延長逐漸降低。
　?、谠诜抢着撩顾睾屠着撩顾刂g：雷帕霉素正常對照組、假手術組Beclin-1蛋白表達量與非雷帕霉素組無顯著差異，雷帕霉素腎缺血組和HBO+腎缺血組Beclin-1蛋白表達量顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01），雷帕霉素腎IRI組、腎IRI+HBO組均于1h、3h、6hBecli

15、n-1蛋白表達量顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01），12h、24hBeclin-1蛋白表達量顯著低于非雷帕霉素組（P<0.01）。
　?。?）LC3-II：主要表達于腎小管上皮細胞胞漿，少量表達于腎小球。相對定量結果顯示：
　?、僭诜抢着撩顾睾屠着撩顾亟M均可見假手術組LC3-II蛋白表達量與正常對照組無顯著差異。在非雷帕霉素正常對照組、假手術組及腎缺血組之間LC3-II蛋白表達量無顯著差異，在雷帕霉素腎缺血組LC3-II蛋

16、白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01）。在在非雷帕霉素和雷帕霉素HBO+腎缺血組LC3-II蛋白表達量均顯著高于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.01）；腎IRI組LC3-II蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.01），腎IRI+HBO組LC3-II蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組及腎IRI組（P<0.01）；假手術組內各時間點LC3-II蛋白表達量無顯著差異；腎IRI組內和腎IRI+HB

17、O組內隨著時間延長LC3-II蛋白表達量逐漸降低，于3h達最低，后隨著時間延長逐漸增加，于24h達最高（P<0.01）。
　?、谠诜抢着撩顾睾屠着撩顾刂g：雷帕霉素各組及對應時間點組LC3-II蛋白表達量均顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01）。
　?。?）PI3K-III：主要表達于腎小管上皮細胞胞漿。相對定量結果顯示：
　?、僭诜抢着撩顾睾屠着撩顾亟M均可見假手術組PI3K-III蛋白表達量與正常對照組無顯著差異；腎缺

18、血組PI3K-III蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01）。在非雷帕霉素HBO+腎缺血組PI3K-III蛋白表達量與正常對照組、假手術組無顯著差異。在雷帕霉素HBO+腎缺血組PI3K-III蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01）。在非雷帕霉素HBO+腎缺血組PI3K-III蛋白表達量顯著低于腎缺血組（P<0.01）。在雷帕霉素HBO+腎缺血組PI3K-III蛋白表達量與腎缺血組無顯著差異。在在非雷帕霉素和

19、雷帕霉素腎IRI組于6h、12h時PI3K-III蛋白表達量顯著高于正常對照組和假手術組（P<0.01），而非雷帕霉素腎IRI組于1h、24h顯著低于腎缺血組（P<0.01），于6h時PI3K-III蛋白表達量顯著高于腎缺血組（P<0.01）。雷帕霉素腎IRI組于1h、3h、6h時PI3K-III蛋白表達量顯著低于腎缺血組，于12h、24h時PI3K-III蛋白表達量顯著高于腎缺血組（P<0.01）。非雷帕霉素腎IRI+HBO組于3h、

20、6h、12h時PI3K-III蛋白表達量顯著高于正常對照組和假手術組（P<0.01）， IRI+HBO組PI3K-III蛋白表達量與腎IRI組無顯著差異。雷帕霉素腎IRI+HBO組PI3K-III蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組及腎IRI組（P<0.01）。在非雷帕霉素和雷帕霉素組假手術組內各時間點PI3K-III蛋白表達量無顯著差異，腎IRI組內和腎IRI+HBO組內各時間點PI3K-III蛋白表達量有顯著差異（P<0.01）。

21、
　?、谠诜抢着撩顾睾屠着撩顾亟M之間：雷帕霉素正常對照組、假手術組及腎缺血組PI3K-III蛋白表達量顯著低于非雷帕霉素組（P<0.01），雷帕霉素HBO+腎缺血組PI3K-III蛋白表達量顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01），雷帕霉素腎IRI組PI3K-III蛋白表達量于1h、12h、24h顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01），于3h、6h顯著低于非雷帕霉素組（P<0.05），雷帕霉素腎IRI+HBO組于1h、3h、12h、24

22、h時PI3K-III蛋白表顯著高于非雷帕霉素組（P<0.05），雷帕霉素腎IRI+HBO組于6hPI3K-III蛋白表顯著低于非雷帕霉素組（P<0.05）。
　?。?）PKC：主要表達于主要表達于腎小球和腎小管間質。相對定量結果顯示：
　　①在非雷帕霉素HBO+腎缺血組、腎缺血組、假手術組及正常對照組之間PKC蛋白表達量無顯著差異。在雷帕霉素假手術組PKC蛋白表達量與正常對照組無顯著差異；腎缺血組PKC蛋白表達量顯著高于正常

23、對照組和假手術組（P<0.01）；HBO+腎缺血組PKC蛋白表達量與正常對照組和假手術組無顯著差異，HBO+腎缺血組PKC蛋白表達量顯著低于腎缺血組（P<0.01）。在在非雷帕霉素和雷帕霉素腎IRI組于3h、6h、12h時PKC蛋白表達量顯均著高于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.01），24h時PKC蛋白表達量顯著低于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.01）；腎IRI+HBO組于3h、6h、12h時PKC蛋白表達量顯著高于

24、正常對照組、假手術組（P<0.01）；腎IRI+HBO組于3h、6h、12h時PKC蛋白表達量顯著低于腎IRI組（P<0.01），24h時PKC蛋白表達量顯著高于腎IRI組（P<0.01）；假手術組內各時間點PKC蛋白表達量無顯著差異；腎IRI組和腎IRI+HBO組組內各時間點PKC蛋白表達量有顯著差異（P<0.01），且隨著時間的延長，PKC蛋白表達量逐漸增加，于6h達最高，后隨著時間延長，逐漸降低，于24h達最低。
　?、谠诜?/p>

25、雷帕霉素和雷帕霉素組之間：雷帕霉素正常對照組、假手術組及HBO+腎缺血組PKC蛋白表達量與非雷帕霉素組無顯著差異，雷帕霉素腎缺血組和腎IRI組于1h、3h、6h、12h時PKC蛋白表達量顯著高于非雷帕霉素組（P<0.05），雷帕霉素腎IRI+HBO組于3h時PKC蛋白表達量顯著低于非雷帕霉素組（P<0.01），雷帕霉素腎IRI+HBO組于24h時PKC蛋白表達量顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01）。
　　（5）Atg-4：主要表達

26、于主要表達于腎小管上皮細胞胞漿。相對定量結果顯示：
　?、僭诜抢着撩顾丶偈中g組Atg-4蛋白表達量與正常對照組無顯著差異；腎缺血組和HBO+腎缺血組Atg-4蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01），HBO+腎缺血組Atg-4蛋白表達量顯著低于腎缺血組（P<0.01）。在雷帕霉素正常對照組、假手術組及HBO+腎缺血組之間的Atg-4蛋白表達量與無顯著差異；腎缺血組Atg-4蛋白表達量顯著低于正常對照組、假手術組（P<

27、0.01）；HBO+腎缺血組Atg-4蛋白表達量顯著高于腎缺血組（P<0.01）。非雷帕霉素腎IRI組Atg-4蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01），腎IRI組Atg-4蛋白表達量顯著低于腎缺血組（P<0.01）。雷帕霉素腎IRI組于1h、3h時Atg-4蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01），6h、24h時Atg-4蛋白表達量顯著低于正常對照組、假手術組（P<0.01）。非雷帕霉素腎IRI+HBO組A

28、tg-4蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01），腎IRI+HBO組于1h、6h、12h時Atg-4蛋白表達量顯著高于腎IRI組（P<0.01），腎IRI+HBO組于3h、24h時Atg-4蛋白表達量顯著低于腎IRI組（P<0.01）。雷帕霉素腎IRI+HBO組于1h、3h、6h時Atg-4蛋白表達量顯著低于正常對照組、假手術組（P<0.01），24h時Atg-4蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組（P<0.01）。在非

29、雷帕霉素和雷帕霉素假手術組內各時間點Atg-4蛋白表達量無差異。非雷帕霉素腎IRI組內各時間點Atg-4蛋白表達量有顯著差異（P<0.01），隨著時間延長Atg-4蛋白表達量逐漸增高，于3h達最高，后隨著時間延長逐漸降低。雷帕霉素腎IRI組內1h時Atg-4蛋白表達量顯著高于3h、6h、12h、24h（P<0.01），隨著時間延長逐漸降低，與6h達最低，12h、24h時Atg-4蛋白表達量顯著高于6h。在非雷帕霉素和雷帕霉素腎IRI+H

30、BO組內各時間點Atg-4蛋白表達量有顯著差異（P<0.01），呈逐漸降低的趨勢，于24h達最低。
　　②：在非雷帕霉素和雷帕霉素組之間：雷帕霉素正常對照組和假手術組各時間點Atg-4蛋白表達量均顯著高于非雷帕霉素組（P<0.01），雷帕霉素各組Atg-4蛋白表達量均顯著低于非雷帕霉素組（P<0.01）。
　　5.Western blot檢測腎組織LC3-II蛋白的表達變化
　?。?）在非雷帕霉素和雷帕霉素組均可見假手

31、術組LC3-II蛋白表達量與正常對照組無顯著差異。非雷帕霉素腎缺血組和HBO+腎缺血組LC3-II蛋白表達量顯著高于正常對照組和假手術組（P<0.05），HBO+腎缺血組LC3-II蛋白表達量顯著高于腎缺血組（P<0.05）。雷帕霉素腎缺血組和HBO+腎缺血組LC3-II蛋白表達量顯著低于正常對照組和假手術組（P<0.01），HBO+腎缺血組LC3-II蛋白表達量與腎缺血組無顯著差異。非雷帕霉素腎IRI組LC3-II蛋白表達量顯著高于正

32、常對照組和假手術組（P<0.01），腎IRI于3h時LC3-II蛋白表達量顯著低于腎缺血組（P<0.01）。雷帕霉素腎IRI組LC3-II蛋白表達量顯著低于正常對照組、假手術組及腎缺血組（P<0.05）。在非雷帕霉素和雷帕霉素腎IRI+HBO組各時間點LC3-II蛋白表達量顯著高于正常對照組、假手術組及腎IRI組（P<0.05）；假手術組內各時間點LC3-II蛋白表達量無顯著差異；腎IRI組內和腎IRI+HBO組內各時間點LC3-II蛋

33、白表達量有顯著差異（P<0.01），且隨著時間延長，LC3-II蛋白表達量逐漸增高，于24h達最高。
　?。?）在非雷帕霉素和雷帕霉素組之間：雷帕霉素各組LC3-II蛋白表達量均顯著高于非雷帕霉素組（P<0.05）。
　　6. SCr和LC3-II的相關性分析
　　相關分析顯示，小鼠SCr值與腎組織LC3-II蛋白表達量的相關系數(shù)，在非雷帕霉素組為r=0.7156，在雷帕霉素組為r=0.6719，P值均小于0.01，均

34、存在正相關關系。
　　結論：
　　1.HBO預處理對腎缺血損傷起保護作用。
　　2.早期HBO治療能夠減輕腎IRI，隨著時間延長，HBO的保護效應減弱。
　　3.自噬的激活加重了腎IRI，HBO治療在保護腎IRI的同時也激活了自噬，HBO治療在腎IRI中發(fā)揮了雙重作用。
　　4.在腎IRI中，HBO治療主要通過和Beclin1-Atg14-Vps34-Vps15信號通路激活自噬。
　　5.在腎IRI中