過度運(yùn)動誘發(fā)大鼠急性心肌損傷p38MAPK和HSP70表達(dá)及諾迪康膠囊的干預(yù)作用.pdf

1、研究目的：
　　隨著競技體育比賽的日益激烈，過度運(yùn)動逐漸成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。過度訓(xùn)練致急性心肌損傷(overtraining-induced acute myocadial injury, OTIAMI)對運(yùn)動員心臟造成很大傷害，甚至引起運(yùn)動員猝死，目前臨床上尚缺乏有效的防治措施。因此，進(jìn)一步認(rèn)識OTIAMI的發(fā)病機(jī)制，探索其防治措施是目前運(yùn)動醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大課題。本研究擬觀察單次力竭運(yùn)動后恢復(fù)期不

2、同時(shí)間點(diǎn)（運(yùn)動后0h、3h、6h、12h和24h）大鼠心肌組織病理學(xué)變化以及大鼠血清和心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2、HSP70的動態(tài)變化規(guī)律；同時(shí)研究諾迪康膠囊0.90g/kg和0.45g/kg大小兩個(gè)劑量干預(yù)給藥對大鼠力竭性游泳運(yùn)動后3h、6h和24h心肌組織病理學(xué)變化以及血清和心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2和HSP70的影響，以探討p38MAPK、COX-2和HSP70在過度運(yùn)動

3、誘發(fā)大鼠急性心肌損傷中的作用及諾迪康膠囊的干預(yù)作用，為過度訓(xùn)練誘發(fā)急性心肌損傷的發(fā)生和康復(fù)治療提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.模型建立和動物分組
　　利用大鼠尾部負(fù)重進(jìn)行力竭性游泳運(yùn)動建立過度運(yùn)動誘發(fā)急性心肌損傷實(shí)驗(yàn)動物模型。160只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為安靜對照組（n=20）、力竭運(yùn)動組（n=80）、諾迪康膠囊大劑量組（0.90g/kg，n=30）、諾迪康膠囊小劑量組（0.45g/kg，n=30）。

4、安靜對照組不進(jìn)行任何運(yùn)動直接取材；力竭運(yùn)動組大鼠進(jìn)行力竭游泳運(yùn)動，根據(jù)運(yùn)動后恢復(fù)期時(shí)間不同分為0h、3h、6h、12h和24h組（每組分別為10、20、20、10、20只），運(yùn)動結(jié)束后按不同時(shí)間點(diǎn)取材；諾迪康大、小劑量組又各自分為給藥后3h、6h和24h組3個(gè)亞組（每組10只），諾迪康膠囊大、小劑量組在力竭游泳運(yùn)動前，連續(xù)給藥10天。
　　2.觀察指標(biāo)檢測
　　于末次給藥后1h進(jìn)行力竭性運(yùn)動，記錄各組大鼠力竭游泳時(shí)間；腹腔靜

5、脈取血2ml，離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆茫谎杆偃〕鲂呐K，剝離出左心室，切取左心室心尖部位心肌組織，放入福爾馬林中固定三天，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，備HE染色和免疫組化用；剩余的大鼠心肌組織，縱切一分為三：取第一部分心肌組織約100mg，制備10％心肌組織勻漿，離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?；第二部分用液氮迅速制備心肌冰凍?biāo)本，-80℃保存?zhèn)溆茫坏谌糠滞瑯佑靡旱杆僦苽湫募”鶅鰳?biāo)本，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　蘇木精-伊紅染色法

6、(hematoxylin-eosin, HE)觀察各組大鼠心肌組織病理改變；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測各組大鼠血清和組織勻漿中p38MAPK、HSP70和COX-2的表達(dá)變化；免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical, IHC)和Western blotting(WB)檢測各組大鼠心肌p-p38MAPK、HSP70和COX-2的蛋白表達(dá)變化；利

7、用熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative RCR, RT-PCR)法檢測心肌組織中p38MAPK mRNA、HSP70 mRNA和COX-2 mRNA的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.力竭性運(yùn)動后不同時(shí)相大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變及諾迪康膠囊的干預(yù)作用
　　HE染色結(jié)果顯示，安靜對照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常。力竭運(yùn)動后不同時(shí)相大鼠心肌組織均有不同程度損傷，其中以運(yùn)動后24h最為嚴(yán)

8、重。諾迪康膠囊大劑量6h、24h組以及諾迪康膠囊小劑量24h組，大鼠心肌組織病理學(xué)明顯改善。
　　2.力竭性運(yùn)動后不同時(shí)相大鼠血清中p38MAPK、COX-2和HSP70含量的動態(tài)變化及諾迪康膠囊的干預(yù)作用
　　ELISA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與安靜對照組比較，力竭性運(yùn)動后3h、6h、12h和24h組大鼠血清p38MAPK、COX-2濃度均顯著升高(P<0.01和P<0.05)，其中p38MAPK分別在3h和24h時(shí)達(dá)高峰；力竭性

9、運(yùn)動后0h、3h、6h、12h和24h組大鼠血清中HSP70濃度均顯著升高(P<0.01)，24h時(shí)達(dá)高峰。與力竭運(yùn)動后3h、6h和24h組比較，諾迪康膠囊大劑量、小劑量3h、6h和24h組大鼠血清中p38MAPK和COX-2濃度均顯著降低(P<0.01和P<0.05)，HSP70濃度均顯著升高(P<0.05)。
　　3.力竭性運(yùn)動后不同時(shí)相大鼠心肌組織中p38MAPK、COX-2和HSP70含量的動態(tài)變化及諾迪康膠囊的干預(yù)作用<

10、br>　　ELISA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與安靜對照組比較，力竭運(yùn)動后3h、6h、12h和24h組大鼠心肌組織勻漿中p38MAPK、COX-2和HSP70濃度均顯著升高(P<0.01和P<0.05)。分別與力竭運(yùn)動后3h、6h和24h組比較，諾迪康膠囊大、小劑量3h、24h組大鼠心肌組織中p38MAPK濃度均顯著降低(P<0.01)，大劑量6h組p38MAPK濃度也顯著降低(P<0.01)；諾迪康膠囊大、小劑量3h、6h、24h組大鼠心肌組織

11、中COX-2濃度均顯著降低(P<0.01)；諾迪康膠囊大、小劑量3h、24h組大鼠心肌組織HSP70濃度均有顯著性增加(P<0.01)，大劑量6h組HSP70濃度也顯著增加(P<0.01)。
　　4.力竭性運(yùn)動后不同時(shí)相大鼠心肌組織中p-p38MAPK、COX-2和HSP70蛋白的表達(dá)及諾迪康膠囊的干預(yù)作用
　　Western-blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與安靜對照組比較，力竭運(yùn)動后3h、6h、12h和24h組大鼠心肌組織

12、中p-p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，其中3h組表達(dá)高峰；COX-2和HSP70蛋白表達(dá)亦顯著性增加(P<0.05和P<0.01)。分別與力竭運(yùn)動后3h、6h和24h組比較，諾迪康膠囊大、小劑量3h、6h和24h組大鼠心肌組織中p-p38MAPK和COX-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.01）；HSP70蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.01)。
　　免疫組織化學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p-p38MAPK、COX-2和HSP7

13、0的表達(dá)在安靜對照組大鼠心肌組織中幾乎沒有表達(dá)，在力竭運(yùn)動后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織病變區(qū)域的表達(dá)明顯增加；諾迪康膠囊大、小劑量組p-p38MAPK、COX-2的表達(dá)減少，HSP70表達(dá)增加。
　　5.力竭性運(yùn)動后不同時(shí)相心肌組織中p38MAPKmRNA、COX-2mRNA和HSP70mRNA的表達(dá)及諾迪康膠囊的干預(yù)作用
　　RT-PCR結(jié)果表明，與安靜對照組比較，力竭性運(yùn)動后3h、6h和24h組大鼠心肌組織中p38MAPKm

14、RNA、COX-2mRNA和HSP70mRNA的表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05)。分別與力竭運(yùn)動后3h、6h和24h組比較，諾迪康膠囊大、小劑量組均明顯降低力竭運(yùn)動后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織中p38MAPKmRNA和COX-2mRNA的表達(dá)量(P＜0.01)；諾迪康膠囊大、小劑量組均可顯著升高HSP70mRNA表達(dá)量(P＜0.01)，其中大劑量組6h達(dá)高峰，隨后有所下降。
　　結(jié)論：
　　1.本文成功建立了過度運(yùn)動誘發(fā)急性心肌

15、損傷模型。
　　2.力竭性運(yùn)動后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織有不同程度的損傷。諾迪康膠囊0.90g/kg和0.45g/kg劑量可以改善力竭性運(yùn)動后大鼠心肌形態(tài)學(xué)改變。
　　3. ELISA、Western-blotting及免疫組化法三種不同方法均證實(shí)，力竭性運(yùn)動可以引起運(yùn)動后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清和心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2和HSP70蛋白表達(dá)不同程度的升高，諾迪康膠囊可以降低心肌組織中p-p38MAP

16、K、COX-2蛋白表達(dá)，同時(shí)增加HSP70蛋白表達(dá)。
　　4. RT-PCR結(jié)果證實(shí)，力竭性運(yùn)動后不同時(shí)相心肌組織中 p38MAPKmRNA、COX-2mRNA和HSP70mRNA表達(dá)均顯著性的升高，諾迪康膠囊0.90g/kg和0.45g/kg劑量可以降低p38MAPKmRNA、COX-2mRNA表達(dá)水平，同時(shí)升高HSP70mRNA表達(dá)水平。
　　5.不同方法均證實(shí)了p38MAPK、COX-2、HSP70參與了力竭運(yùn)動誘發(fā)的