斷藤益母湯及其組方藥物對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠骨代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過本研究，希望能夠明確斷藤益母湯對RA骨代謝影響的確切作用，重點(diǎn)探討RANKL/OPG信號通路和Wnt/β-catenin信號通路在RA骨代謝中的作用機(jī)制和斷藤益母湯的作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.斷藤益母湯及其組方藥物對CIA大鼠的治療作用
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明

2、山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為8只。
　　處理方法:應(yīng)用經(jīng)典的RA模型——膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型，各干預(yù)組在CIA大鼠模型加強(qiáng)免疫7天后即在造模第14天開始給予相應(yīng)的處理。根據(jù)臨床計(jì)量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻(xiàn)給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純

3、凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標(biāo):大鼠一般情況觀察，如體毛、活動、飲食、排泄等，體重變化，關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)評分，大鼠左、右后足爪容積;HE染色法觀察大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨的病理學(xué)改變情況;ELISA法測量大鼠血清TNF-α濃度。
　　數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用重復(fù)測量資料的

4、方差分析和one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.斷藤益母湯及其組方藥物對CIA大鼠骨密度、骨小梁分析的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲

5、氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為4只。
　　處理方法:應(yīng)用CIA大鼠模型，各干預(yù)組在加強(qiáng)免疫7天后即在造模第14天開始給予相應(yīng)的處理。根據(jù)臨床計(jì)量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻(xiàn)給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標(biāo):Micro-CT影像學(xué)評

6、價(jià);骨骼礦物質(zhì)參數(shù)指標(biāo):骨礦物質(zhì)含量(bonemineral content，BMC)、骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）;體視學(xué)測量參數(shù)指標(biāo):骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecularnumber，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，骨表面積/體積(bone surfacearea/bone vo

7、lume，BS/BV)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp);結(jié)構(gòu)模型指數(shù)參數(shù)指標(biāo):骨小梁模式因子(trabecular pattern factor，Tb.Pf)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index, SMI)。
　　數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD

8、檢驗(yàn)，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.斷藤益母湯及其組方藥物對CIA大鼠破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為8只。
　　處理方法:應(yīng)用CIA大

9、鼠模型，各干預(yù)組在加強(qiáng)免疫7天后即在造模第14天開始給予相應(yīng)的處理。根據(jù)臨床計(jì)量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻(xiàn)給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標(biāo):抗酒石酸酸性磷酸酶及堿性磷酸酶(TRACP&ALP)雙重染色法觀測大鼠踝關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞(osteoclast

10、，OC)和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的數(shù)量;ELISA法檢測大鼠血清OC標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和OB標(biāo)志物骨堿性磷酸酶(BALP)的濃度。
　　數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.斷藤

11、益母湯及其組方藥物對PANKL/OPG信號通路的調(diào)節(jié)作用
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為8只。
　　處理方法:應(yīng)用CIA大鼠模型，各干預(yù)組在加強(qiáng)免疫7天后即在造模第14天開始給予相應(yīng)的處理。根據(jù)臨床計(jì)量換算，KDM、

12、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻(xiàn)給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標(biāo):免疫組化法(IHC)觀測大鼠踝關(guān)節(jié)RANKL、OPG的蛋白表達(dá)量;ELISA法檢測大鼠血清RANKL、OPG的濃度。
　　數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±

13、s)表示，采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.斷藤益母湯及其組方藥物對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)作用
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組(Control)、模型組(Model)、斷藤益母湯組(KDM)、昆斷湯組(KD)、昆母湯組(KM)、昆明山海棠組(THH)、甲氨蝶呤組(MTX)。以正常大鼠作為

14、空白對照，以甲氨蝶呤(MTX)作為陽性對照。每組樣本量為4只。
　　處理方法:應(yīng)用CIA大鼠模型，各干預(yù)組在加強(qiáng)免疫7天后即在造模第14天開始給予相應(yīng)的處理。根據(jù)臨床計(jì)量換算，KDM、KD、KM、THH4個中藥組分別給予THH劑量4g/kg/d; MTX組參照文獻(xiàn)給予0.9mg/kg/w; Control、Model組給予純凈水4ml/kg/d。陽性對照組每周灌胃1次，其余組每天灌胃1次，連續(xù)4周。
　　觀測指標(biāo):QPCR法

15、檢測大鼠踝關(guān)節(jié)Wnt3a、β-catenin、Dickkopf-1的mRNA的表達(dá)。
　　數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較方差齊性時選用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時選用Tamhane T2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　斷藤益母湯、昆斷湯、昆母湯、昆明山海棠及甲氨喋呤均能不同程度改善CIA大鼠的骨侵

16、蝕情況，其中斷藤益母湯組在抑制炎癥指標(biāo)和促進(jìn)骨保護(hù)方面均優(yōu)于昆斷湯、昆母湯、昆明山海棠及甲氨喋呤組;昆斷湯在促進(jìn)骨保護(hù)方面優(yōu)于昆母湯、昆明山海棠及甲氨喋呤組;昆母湯在抑制炎癥指標(biāo)方面優(yōu)于昆斷湯、昆明山海棠及甲氨喋呤組。
　　斷藤益母湯能降低CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中RANKL的表達(dá)、升高OPG的表達(dá)，抑制RANKL/OPG信號通路對破骨細(xì)胞的分化、成熟，抑制骨吸收;同時能升高CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中Wnt3a、β-catenin的mRNA表達(dá)、