肺結(jié)核病生物學標志物miRNAs篩選、鑒定及miRNA和MRC1 SNPs與肺結(jié)核病易感性的研究.pdf

1、第一部分血清miRNAs作為肺結(jié)核病新分子標志物的篩選與鑒定
　　研究背景:結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）引起的慢性感染性疾病，可侵及許多臟器，以肺部結(jié)核(PulmonaryTuberculosis，PTB)感染最為常見，占各器官結(jié)核病總數(shù)的80-90％，發(fā)展成為肺結(jié)核病。肺結(jié)核病是一種嚴重威脅人類健康的疾病之一。肺結(jié)核病防治最突出的難點是缺乏

2、疾病特異性的早期診斷標志物，無法獲得早期診斷，導致肺結(jié)核病高發(fā)和死亡率的上升。為此，迫切需要研究肺結(jié)核病特異生物學標志物，建立一種快速、敏感、高效的肺結(jié)核病診斷和鑒別的新方法，防止肺結(jié)核病蔓延。本研究從血清miRNAs的表達譜中，篩選能作為肺結(jié)核病生物標志物，建立血清miRNA組合物，作為臨床診斷的潛在新分子標志物。
　　研究方法:本研究收集血清樣本326例，其中健康對照者108例，肺結(jié)核病患者128例，鑒別診斷組疾病患者90例，

3、包括肺癌、肺炎和慢性阻塞性病患者各30例。應(yīng)用Solexa測序技術(shù)進行初步篩查，檢測20例肺結(jié)核病患者和20例健康對照者中血清miRNAs;應(yīng)用熒光定量PCR方法，在108例肺結(jié)核病患者、88例健康對照者，以及90例鑒別診斷組疾病患者血清樣本中驗證差異表達的血清miRNAs;通過ROC曲線和Logistic回歸模型分析，對單個血清miRNAs和miRNAs組合對肺結(jié)核病診斷的靈敏度和特異性進行比較和分析;最后應(yīng)用預(yù)測miRNAs調(diào)控的靶

4、基因和全基因組轉(zhuǎn)錄概況，構(gòu)建與肺結(jié)核病相關(guān)的靶基因和miRNAs的網(wǎng)絡(luò)圖。
　　研究結(jié)果:應(yīng)用Solexa測序技術(shù)檢測肺結(jié)核病患者和健康對照者的血清miRNAs，在肺結(jié)核病患者中，選擇具有顯著性差異的15個血清miRNAs，其中10個血清miRNAs表達量上調(diào)，5個血清miRNAs表達量下調(diào);通過熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)，在肺結(jié)核病患者和健康對照者中，有6個血清miRNAs（hsa-miR-378、hsa-miR-483-5p、hs

5、a-miR-22、hsa-miR-29c、hsa-miR-101和hsa-miR-320b）具有顯著性差異（P＜0.001）。并且在肺結(jié)核患者和鑒別診斷組之間進行比較均具有顯著性差異(P＜0.05);通過對這6個血清miRNAs單個的ROC曲線進行分析，顯示單個血清miRNAs的AUC在0.702到0.880之間;通過Logistic回歸模型方法計算6個血清miRNAs組合物的AUC為0.982(95％ CI，0.929-0.998)，

6、靈敏度為95.0％和特異性為91.8％。MiRNAs-Gene網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖顯示miRNAs可能是調(diào)控機體的免疫通路相關(guān)基因，參與肺結(jié)核病的發(fā)生過程。
　　結(jié)論:(1)建立Solexa測序技術(shù)結(jié)合qRT-PCR檢測技術(shù)，可快速穩(wěn)定靈敏地構(gòu)建肺結(jié)核血清miRNAs指紋圖譜檢測技術(shù);(2)篩選了肺結(jié)核病相關(guān)特異的6個血清miRNAs，為建立肺結(jié)核病臨床早期快速特異診斷的標準，提高肺結(jié)核病的防治水平奠定基礎(chǔ);(3)鑒定和構(gòu)建血清miRNAs

7、組合可能是肺結(jié)核病的診斷潛在的新分子標志物，為進一步研究miRNAs在肺結(jié)核病中的致病機制奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 MiR-146a，miR-149，miR-196a2和miR-499 SNPs與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群肺結(jié)核病易感性的研究
　　研究目的:MiRNAs是一類非編碼RNA，以mRNA為靶標并抑制mRNA表達蛋白。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生在miRNAs的前體中，通過影響miRNAs的表達或者成熟導致其正常功

8、能的發(fā)揮，并且可能通過修飾miRNAs調(diào)控影響表型類型和疾病易感性。人類miRNAs基因中的數(shù)個SNP可能影響miRNAs的生物合成和功能，可能參與肺結(jié)核病的發(fā)生機制。本實驗首次研究miR-146aC＞G、miR-149T＞C、miR-196a2 T＞C和miR-499 A＞G SNPs位點與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群肺結(jié)核病易感性，揭示這4個miRNAs SNPs位點基因可能是肺結(jié)核病的候選易感基因。
　　研究方法:應(yīng)

9、用PCR-PFLR方法分析SNPs的分布頻率。本研究共收集654例南方漢族人群血樣（健康對照組300例，肺結(jié)核病組354例）、662例維吾爾族人群血樣（健康對照組361例，肺結(jié)核病組301例）和612例哈薩克族人群血樣（健康對照組361例，肺結(jié)核病組251例）。對基因型及基因頻率分布進行檢測，并對遺傳模式和連鎖不平衡進行分析。
　　研究結(jié)果:在維吾爾族人群中miR-499 A＞G SNP位點的等位基因A(P=0.003;OR=1.

10、563;95％ CI，1.162-2.103)和基因型GG型(P=0.001;OR=5.344;95％ CI，1.803-15.83)在肺結(jié)核病組和健康對照組之間存在顯著性差異;在年齡和性別校正后，發(fā)現(xiàn)miR-499 A＞G SNP位點在共顯性(P=0.0014; OR=5.37;95％ CI，1.81-15.92)、顯性（P=0.029; OR=1.47;95％ CI，1.04-2.09）、隱性（P=7e-04; OR=4.95;95

11、％ CI，1.68-14.55）和加性模式（P=0.0027; OR=1.57;95％ CI，1.16-2.11）下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性;連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的單體型CTCC與肺結(jié)核病的發(fā)生具有顯著相關(guān)性（P=0.044; OR=7.19;95％ CI，1.01-51.14）;MiR-146aC＞G、miR-149 T＞C和miR-196a2 T＞C SNPs位點的等位基因頻率和基因型在肺結(jié)核病組和健康對照組之間的分布均無顯著性

12、差異(P＞0.05)。在哈薩克族人群中，miR-146aC＞G位點的等位基因G(P=0.023; OR=1.33;95％ CI，1.04-1.69)和CC型（P=0.013;OR=1.84;95％ CI，1.14-2.98）在兩組之間存在顯著性差異;同時miR-196a2 T＞C SNP位點的等位基因C(P=0.008; OR=0.73;95％CI，0.58-0.92)和基因型TT型（P=0.013;OR=0.54;95％ CI，0.3

13、3-0.88）在兩組之間存在顯著性差異;經(jīng)年齡和性別校正后，發(fā)現(xiàn)miR-146aC＞G SNP位點在共顯性(P=0.019; OR=1.87;95％ CI，1.15-3.03)、隱性(P=0.005;OR=1.84;95％ CI，1.20-2.81)和加性模式(P=0.022; OR=1.33;95％ CI，1.04-1.69)下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性;miR-196a2 T＞C SNP位點在共顯性(P=0.029; OR=0.54;

14、95％ CI，0.33-0.88)、顯性（P=0.014; OR=0.65;95％ CI，0.46-0.92）和加性模式(P=0.0083;OR=0.73;95％ CI，0.58-0.92)下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性;miR-149 T＞C和miR-499 A＞G SNPs位點的基因型頻率在健康對照組與肺結(jié)核病組之間的分布均無顯著性差異(P＞0.05)。在南方漢族人群中，構(gòu)建的單體型TCCC(P=0.044;OR=0.23;95％ CI

15、,0.05-0.96)和CCCT(P=0.024; OR=0.03;95％ CI,0.01-0.63)與肺結(jié)核病的保護效應(yīng)具有顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論:(1)利用病例-對照方法，結(jié)合統(tǒng)計學分析，首次對miR-499 A＞G、miR-146aC＞G、miR-149 T＞C和miR-196a2 T＞C SNPs位點與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群結(jié)核病的易感性進行關(guān)聯(lián)研究;(2) miR-499A＞G SNP位點與維吾爾族人群肺結(jié)

16、核病的易感性相關(guān)，可能增加肺結(jié)核病的發(fā)生風險;miR-146aC＞G、miR-149T＞C和miR-196a2 T＞C SNPs與維吾爾族人群肺結(jié)核病的不存在相關(guān)性;(3) miR-146aC＞G和miR-196a2 T＞C SNPs位點與哈薩克族人群肺結(jié)核病發(fā)生的相關(guān);miR-149T＞C和miR-499A＞G SNPs與哈薩克族人群肺結(jié)核病的不存在相關(guān)性;(4) miR-146aC＞G、miR-149T＞C、miR-196a2 T＞

17、C和miR-499 A＞G SNPs位點與中國南方漢族肺結(jié)核病易感不存在相關(guān)性。提示miRNA SNPs與肺結(jié)核易感具有種族差異性。
　　第三部分在中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群中的MRC1基因多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性的研究
　　研究背景:機體識別結(jié)核分枝桿菌并介導免疫應(yīng)答主要依賴T淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞表面的模式識別受體(Pattern RecognitionReceptors，PRRs)。MRC

18、1基因編碼的PRRs家族的甘露糖受體，屬于C型凝集素超家族成員，可通過胞外區(qū)識別和結(jié)合結(jié)核分枝桿菌、遞呈抗原和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮作用。目前尚沒有MRC1基因SNPs與結(jié)核病易感性報道。本實驗研究中國新疆地區(qū)維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群MRC1基因第7號外顯子基因多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性，揭示MRC1基因可能是肺結(jié)核病的候選易感基因。
　　研究方法:應(yīng)用PCR和DNA測序技術(shù)，對中國新疆地區(qū)595例維吾爾族人群血樣（健康對照組3

19、45例，肺結(jié)核病組250例）、513例哈薩克族人群血樣（健康對照組325例，肺結(jié)核病組188例）和454例南方漢族人群血樣（健康對照組226例，肺結(jié)核病組230例）MRC1基因第7號外顯子的6個單核苷酸多態(tài)性（G1186A、G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T）基因型及基因頻率分布進行檢測，并對6個位點進行連鎖不平衡分析。
　　研究結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)在維吾爾族人群中MRC1基因的G1186A位點的等位基

20、因G的分布頻率在肺結(jié)核病組(0.464)中低于健康對照組(0.536)，并且在維吾爾族肺結(jié)核病組和健康對照組之間的分布具有顯著性差異(P=0.029; OR=1.29;95％ CI，1.02-1.63);基因型分析發(fā)現(xiàn)MRC1基因的G1186A位點基因型AA型在肺結(jié)核病組的頻率低于健康組，在兩組之間也存在顯著性差異(P=0.037; OR=1.66;95％ CI，1.05-2.61);在年齡和性別校正后，MRC1基因的G1186A位點在

21、加性模式下與肺結(jié)核病存在相關(guān)性(P=0.039; OR=1.27;95％ CI，1.01-1.60)。從MRC1基因SNPs位點的連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的GGTCCT單體型(P=0.034;OR=0.75;95％ CI，0.57-0.98)和GGTCCC單體型(P=0.043; OR=0.57;95％ CI，0.33-0.98)與肺結(jié)核病存在顯著的相關(guān)性，其余5個SNP位點(G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1

22、323T)與肺結(jié)核病的易感性不存在顯著相關(guān)性(P＞0.05)。在哈薩克族人群中發(fā)現(xiàn)MRC1基因的6個SNPs位點的等位基因頻率和基因型頻率在肺結(jié)核病組和健康對照組之間的分布均無顯著性差異(P＞0.05)。在漢族人群中MRC1基因的G1186A等位基因G的分布頻率在肺結(jié)核病組中高于正常健康組，兩組間分布存在顯著差異（P=0.023;OR=0.76;95％ CI，0.57-0.95）?；蛐头治鲆脖砻髟撐稽c的AG型在漢族人群正常健康組與肺結(jié)

23、核病存在顯著相關(guān)性(P=0.0076; OR=0.55;95％ CI，0.36-0.85)。在年齡和性別校正后，G1186A位點在顯性(P=0.0057; OR=0.57;95％ CI，0.38-0.85)、超顯性(P=0.039; OR=0.68;95％CI，0.47-0.98)和加性模式（P=0.03;OR=0.75;95％ CI，0.58-0.97）下，與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性。而其它5個SNP位點(G1195A、T1212C、C

24、1221G、C1303T和C1323T)與肺結(jié)核病無相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)利用病例-對照方法，結(jié)合統(tǒng)計學分析，首次對MRC1基因第7號外顯子區(qū)域的6個SNPs位點與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群結(jié)核病的易感性進行關(guān)聯(lián)研究;(2) MRC1基因的G1186A位點與維吾爾族人群肺結(jié)核病的易感性相關(guān)，可能增加肺結(jié)核病發(fā)病率;可能是南方漢族人群肺結(jié)核的保護因子，并且可能減少中國漢族人群感染肺結(jié)核病的風險;與哈薩克