甲烷飽和鹽水對慢性炎性痛模型大鼠鎮(zhèn)痛作用的研究.pdf

1、研究目的:
　　慢性炎性痛，是臨床病理性疼痛的主要類型之一，如果得不到及時(shí)而有效的治療，將成為一個(gè)代價(jià)高昂的健康問題，不但降低了病人的生活品質(zhì)，另一方面也帶給病人個(gè)體、家庭及政府沉重的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此慢性炎性痛防治是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。而由于其病理生理機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，給臨床實(shí)踐（臨床診斷與治療）和基礎(chǔ)科學(xué)研究帶來重大的挑戰(zhàn)與機(jī)遇。既往研究表明，氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥均是慢性炎性痛發(fā)病的主要機(jī)制之一。在外周組織損傷、

2、感染或腫瘤生長的情況下，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化合成分泌多種炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激產(chǎn)物、降低抗氧化能力，這些因素互相作用，構(gòu)成局部炎癥微環(huán)境，最終改變突觸傳遞的可塑性，從而形成了中樞敏化。其主要表現(xiàn)為自發(fā)痛，痛覺過敏和痛覺異常。
　　甲烷(CH4)，無色無味，分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，是天然氣和煤氣等氣體燃料及可燃冰的主要成分。甲烷可以通過哺乳動(dòng)物腸道中的厭氧菌利用食物中的碳水化合物無氧酵解產(chǎn)生。由于吸入甲烷混合氣存在易爆危險(xiǎn)，目前研究多采用甲烷飽

3、和鹽水研究其生理作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，甲烷可在大鼠肝臟線粒體和真核細(xì)胞中生成，并具有抗氧化、抗炎和抗細(xì)胞凋亡的作用;而這些作用在后續(xù)的缺血再灌注、膿毒癥和結(jié)腸炎等模型中得到證實(shí)，并顯示其具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而甲烷是否對大鼠慢性炎性痛具有治療作用尚未見報(bào)道。本研究擬觀察甲烷對完全弗式佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛的痛行為學(xué)的影響，探索其可能的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　本研究采用CFA注射至大鼠踝關(guān)節(jié)致炎建立大鼠慢性炎性痛

4、模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)、western blot及ELASA等實(shí)驗(yàn)方法，依下面所述步驟初步觀察甲烷飽和鹽水對慢性炎性痛大鼠的痛行為的作用，探索其相關(guān)作用機(jī)制。
　　一、觀察甲烷飽和鹽水對慢性炎性痛大鼠痛行為的影響
　　選擇SD大鼠(體重約200-300g)建立單關(guān)節(jié)炎慢性炎性痛模型。觀察MA大鼠在單次腹腔內(nèi)或者重復(fù)腹腔內(nèi)注射甲烷飽和鹽水后，術(shù)測后足機(jī)械痛縮腿反應(yīng)閾值(Paw withdrawal thresho

5、ld，PWT)變化情況。
　　二、觀察甲烷飽和鹽水對慢性炎性痛大鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷飽和鹽水或者生理鹽水后，術(shù)后第10d取同側(cè)脊髓背角，用免疫蛋白印跡技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP及小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物IBA1的表達(dá)水平。探討甲烷飽和鹽水是否通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活性來治療慢性炎性痛。
　　三、觀察甲烷飽和鹽水對于慢性炎性痛大鼠脊髓外周T淋巴細(xì)胞浸潤的影響
　　建立MA模型，

6、腹腔注射甲烷飽和鹽水或者生理鹽水后，術(shù)后第10d取脊髓腰膨大，用流式細(xì)胞術(shù)檢測脊髓腰膨大節(jié)段中T細(xì)胞數(shù)量。探討甲烷飽和鹽水與慢性炎性痛大鼠外周T淋巴細(xì)胞脊髓浸潤的關(guān)系。
　　四、觀察甲烷飽和鹽水對脊髓氧化應(yīng)激水平的影響
　　建立慢性炎性痛模型后，用分光光度法檢測術(shù)后第0d、3d、7d、10d同側(cè)脊髓背角氧化應(yīng)激的標(biāo)記物超氧化物歧化酶(Superoxyde dismutase:SOD)及過氧化氫酶(catalase:CAT)活

7、性及丙二醛(malonaldehyde:MDA)濃度，用免疫組織化學(xué)的方法術(shù)后第10d檢測同側(cè)脊髓背角細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平即8羥基脫氧鳥苷(8OHDG)表達(dá)情況。初步分析甲烷飽和鹽水是否通過抗氧化應(yīng)激途徑來影響慢性炎性痛。
　　五、觀察甲烷飽和鹽水對于慢性炎性痛大鼠脊髓炎癥介質(zhì)的表達(dá)的影響
　　建立MA模型，腹腔注射甲烷飽和鹽水或者生理鹽水后，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測第10d同側(cè)脊髓背角中炎性因子（白介素1β、腫瘤壞死因子α、白

8、介素10）的表達(dá)情況;探討甲烷飽和鹽水能否抑制脊髓背角炎癥介質(zhì)的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　一、甲烷飽和鹽水可以顯著提高慢性炎性痛大鼠機(jī)械痛縮腿反應(yīng)閾值
　　與NS處理相比，單次MS(10ml/kg)經(jīng)腹腔注射后(SD大鼠分兩組，術(shù)后第3天分別接受NS或MS腹腔注射，間隔2天后分別接受MS或NS腹腔注射)可暫時(shí)升高M(jìn)A大鼠的PWT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);這種效應(yīng)具體表現(xiàn)為在處理后1h達(dá)到峰值，而后開始降低

9、，總有效時(shí)間大約4h。而MS連續(xù)給藥（術(shù)前1h及術(shù)后每天給藥一次，共計(jì)11次）于術(shù)后第3天開始可顯著提高大鼠的PWT，并至少持續(xù)到第10天(p＜0.05)。
　　二、甲烷飽和鹽水可抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化
　　踝關(guān)節(jié)致炎后同側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化(p＜0.05)。與生理鹽水組相比，甲烷飽和鹽水組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度顯著降低(p＜0.05)。
　　三、甲烷飽和鹽水可抑制外周T

10、淋巴細(xì)胞的脊髓浸潤
　　與假手術(shù)組相比，踝關(guān)節(jié)致炎能夠誘導(dǎo)外周T淋巴細(xì)胞向同側(cè)脊髓背角浸潤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。與生理鹽水組相比，甲烷飽和鹽水組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角中CD3+T細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例顯著降低(p＜0.01)。
　　四、甲烷飽和鹽水顯著降低慢性炎性痛大鼠脊髓背角氧化應(yīng)激水平
　　與假手術(shù)組相比，MA組大鼠脊髓SOD、CAT活性降低，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和8OHDG表達(dá)上調(diào)(p＜0.01)。而甲烷

11、飽和鹽水連續(xù)給藥可以部分恢復(fù)MA誘導(dǎo)的脊髓背角SOD和CAT的活性(p＜0.05)。同時(shí)，與生理鹽水組相比，甲烷飽和鹽水處理組脊髓背角氧化產(chǎn)物MDA和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物8OHDG的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。
　　五、甲烷飽和鹽水能夠降低慢性炎性痛大鼠脊髓炎性介質(zhì)表達(dá)水平
　　與假手術(shù)組相比，MA組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)表達(dá)上調(diào)，抑炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。而甲烷飽和鹽水連

12、續(xù)給藥后可以抑制模型大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α的過表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)IL-10的表達(dá)(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　在CFA誘導(dǎo)的單關(guān)節(jié)炎慢性疼痛模型大鼠中，腹腔注射甲烷飽和鹽水能顯著提高模型大鼠PWT，同時(shí)抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化、減少外周T細(xì)胞脊髓浸潤數(shù)量，下調(diào)氧化應(yīng)激產(chǎn)物及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，保護(hù)抗氧化能力及上調(diào)抑炎細(xì)胞因子的表達(dá)，最終減輕大鼠的慢性炎性痛。本研究提示，甲烷飽和鹽水可能通過抗氧化應(yīng)激和抗神經(jīng)炎癥